PKH26 细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）

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产品关键词：

PKH26；Calcein AM钙黄绿素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking 体内细胞示踪；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

产品信息

【好消息】：应客户的要求，我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应，产品信息如下：

产品描述

PKH26细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）（PKH26 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于荧光探针PKH26，用于常规细胞膜标记的检测试剂盒，适用于体外细胞标记，体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH26是一种专利的膜标记探针，结构上带有一长脂肪族尾巴，能稳定插入细胞膜脂质区域。PKH26荧光处于黄-橙色光谱区间（见图1），最大激发波长为551nm，最大发射波长是567nm，与罗丹明或PE检测系统兼容。也可能用标准荧光素（Fluorescein）激发滤片，但荧光强度可能会有些降低。PKH26具最长的体内半衰期，超过100天，非常适用于体内细胞示踪、细胞增殖研究和其他长期实验。

稀释液C（Diluent C）是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液，特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力，同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的，不含去污剂或有机溶剂，也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型，染料标记后膜的内在化程度，标记细胞可能呈现不同的状态，从明亮，到均匀点状或斑驳状。然而，PKH26荧光在生理范围内不依赖于pH，且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH26的激发和发射光谱图

我司（懋康生物）提供三种规格的PKH26细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4021-100UL）建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积（含2μM 终浓度的PKH26），本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于5次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit（CAT#：MX4021-200UL）适用于中量研究。当使用2ml染色体积（含2μM 终浓度的PKH26），本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积（含2μM 终浓度的PKH26），本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度

产品包装

保存与运输方法

保存：2-8ºC避光保存，1年有效。其中组分A（PKH26 Dye）需严格避光，盖子保持拧紧。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）   PKH26是以溶于乙醇的储存液形式提供，保存的过程中需避光并拧紧盖子，以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶，若有结晶，需在37℃水浴溶晶，超声或涡旋直至完全溶解。

2）   Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液，不含任何防腐剂或抗生素，使用和保存过程中都注意无菌。

3）   PKH26不能保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，现配现用。

4）   荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

5）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

一、 自行准备仪器和试剂（试剂盒不提供，用于常规细胞膜标记）

﹒良好分散，均匀的单细胞悬液（悬浮于组织培养基）

﹒含血清的组织培养基（完全培养基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基，或生理盐溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管（4-15ml）

﹒能控温的离心机（高达1000×g）

﹒荧光分析用仪器（荧光酶标板，荧光或共聚焦显微镜，流式细胞仪）

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

二、 常规细胞膜标记

【注意事项】：

1）   通过分配脂质染料进入细胞膜来进行标记。标记强度是染料浓度和细胞浓度共同作用的一种功能，且不会饱和。因此，用来标记的染料浓度需要有限，过度标记细胞会引起细胞膜完整性丧失和降低的细胞复原能力。

2）   以下步骤适用于体外或离体标记干细胞、淋巴细胞、单个核细胞、内皮细胞、神经元或任何需要将染料插入细胞膜脂质区的其他细胞类型。而体内标记、血小板标记，或在含非吞噬细胞的群体内选择性标记吞噬细胞，需对步骤做适当修改。

3）   需在单克隆抗体染色前进行常规细胞膜染色。4℃单克隆抗体染色过程中膜染料仍能维持稳定。然而，如果单抗标记后再室温下进行常规细胞膜染色，极有可能引起单抗的“盖帽”发生。

4）   以下步骤中用到的细胞和染料浓度是推荐用的起始浓度，广谱适用于各种细胞类型。用户需根据自身细胞类型和实验目的确定最佳的染料和细胞浓度，通过对染色后细胞活力（比如碘化丙啶排斥），荧光强度，染色均匀性和对待研究细胞功能无影响等方面来综合评估。

5）   PKH26染色过程中需避免叠氮化物或代谢毒物的存在。

6）   虽然粘附在固相基质上的贴壁细胞可能被标记，使用单细胞悬浮液能得到更匀质的染色结果。染色前使用蛋白消化酶比如胰酶/EDTA处理贴壁或结合细胞制备成分散的单细胞悬液能得到最好的染色结果。

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最终染色体积，含2μM PKH26，以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行（20-25℃）。

1.1    取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液，用无血清培养基清洗细胞一次。

【注意】：血清蛋白和脂质也会结合染料，降低用于膜标记的有效染料浓度。用无血清培养基或缓冲液（Step 1.1）清洗细胞一次，然后再用Diluent C重悬细胞用于标记能得到最佳结果。

1.2    400×g离心细胞5min，得到松散的细胞沉淀。【注意】：PKH26乙醇储存液不能直接加入细胞沉淀上，否则会引起异质染色和降低的细胞活力。

1.3    细胞离心后，轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

【注意】：为了得到重复性结果，最小化残留培养基或缓冲液很重要，然后再将细胞重悬在Diluent C中。

1.4    加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液，用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

【注意】：生理盐离子的存在导致染料形成胶团，实质上降低染色效率。因此，染料添加的时候细胞悬浮在Diluent C中很重要，而不是在培养基或缓冲盐溶液中。

1.5   染色前立即制备2×染色液（4μM in Diluent C）：通过将4μl PKH26乙醇储存液到1ml Diluent C中，充分混匀分散所得。

【注意】：

a）为了最小化乙醇对细胞活力影响，Step 1.5中加入的染料体积产生占Step 1.6中不超过1-2%的乙醇量；b）若想得到＜2μM的最终染料浓度，用未变性的100%无水乙醇稀释试剂盒提供的PKH26乙醇储存液到一中间染料浓度，能得到最好的重复染色结果。

1.6   快速加1ml 2×细胞悬液（Step 1.4）到1ml 2×染色液（Step 1.5），用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml 和2μM PKH26。

【注意】：由于染色几乎是一瞬间发生，在染色工作液中快速且均匀分散细胞对得到明亮、一致和重复的标记结果至关重要。以下措施都有利于得到优化结果：

a.       不要将PKH26乙醇储存液直接加到2×染色液（4μM in Diluent C）中。

b.       混匀等体积的2×细胞悬液（Step 1.4）和2×染色液（Step 1.5）。

c.       调整2×细胞悬液和2×染色液体积，避免在很小（＜100μl）或很大（＞5ml）体积。

d.       使用自动移液器或相同产品用于快速添加细胞和与染料混匀。血清学移液管很慢，得到相对更不一致的染色。“推压”或涡旋也很慢，得到相对更不一致染色。

e.       尽可能精确加量体积，为了精确重复每个样品间和每个研究间用到的细胞和染料浓度。

1.7    Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min，中间定期混合。染色过程非常快，更长时间无任何益处。

【注意】：以获得理想染色结果的最短时间进行细胞孵育。由于Diluent C不含生理盐，更长的细胞孵育可能引起某些细胞类型活力降低。如果猜测可能有此效应产生，那么同时设置一个仅含Diluent的对照和一个使用乙醇染色而不是染料染色的阴性对照（mock-stained control）。

1.8    加入等体积（2ml）血清或其他适当蛋白溶液（比如1% BSA），孵育1min允许结合多余的探针。

【注意】：

a.血清（或等蛋白浓度溶液）更适合用作终止液。如果用完全培养基直接替代血清提高加入体积到10ml。

b. 在终止染色反应前不要通过加入Diluent C或离心细胞到Diluent C来终止。

c.不要使用无血清培养基或生理盐溶液，会引起细胞相关染料聚合物产生。染料聚合物好比未结合染料的“缓释水池”，通过清洗不能有效去除，且会转移到实验体系中的未标记细胞上。

1.9    20-25℃，400×g离心细胞10min，轻轻吸掉上清，确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞，转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中，20-25℃，400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀＞2次，以确保完全去除未结合染料。

【注意】：转移到一干净离心管内能增加清洗效率，通过最小化结合到管壁上的残留染料的交叉污染；不要使用Diluent C用于清洗。

1.10  最后一步清洗后，用10ml完全培养基重悬细胞沉淀，用来评估细胞回收，细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

【注意】：

a.       染色细胞可能用1-2%中性缓冲甲醛固定，若样本避光保存荧光强度可稳定保存至少3周。

b.       染色通常比背景自荧光至少强100-1000倍。荧光分布必须匀称，且尽量均质，虽然染色CV取决于染色细胞类型。

PKH26客户使用案例（逐步增加中。。。。。。）

 图片描述：巨噬细胞（106个/mL）经PKH26（MKBio, 货号：MX4021-100UL，使用浓度：4uL/mL，5min）标记，荧光显微镜（Ex/Em=551nm/567nm）检测。【数据来源：华东理工大学药学院 李老师】

图片描述：斑马鱼体内给PKH26（MKBio，货号：MX4021-100UL）标记以及荧光成像。【数据来源：兰州大学医学院 潘老师 】

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。

Yu Mengyu et al. Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells. Cancer Science. 2019;110:3173–3182.

Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells.

To quantify the amount of erastin@FA‐exo and erastin@exo taken up by MDA‐MB‐231 cells, lipophilic fluorescent dye PKH26 (MaoKang Biotechnology) was used to stain the exosomes. To detect the effect of FA receptor binding on cell uptake, culture medium containing 1.1 mg/mL of free FA was added to MDA‐MB‐231 cells to competitively inhibit FA receptors. After incubation for 6 hours, the cells were washed with PBS 3 times.Then erastin@FA‐exo was added and the cells’ uptake of the drug was observed.

Yanlin Wang et al. Microfluidic Raman biochip detection of exosomes: a promising tool for prostate cancer diagnosis. Lab Chip, 2020,20, 4632-4637https://doi.org/10.1039/D0LC00677G

PKH26 was obtained from Maokangbio Co., Ltd (Shanghai, China).

鉴于近期大量的用户咨询PKH26用于外泌体染色（exosome stain）的方法，我司查阅相关文献资料，提供染色相关的一些信息，仅供交流学习用。

摘自文献1）Pužar Dominkuš P et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2018 Jun;1860(6):1350-1361. PMID: 29551275

◇◇ 外泌体染色（Exosome staining）(简单流程见Fig 1)

外泌体冻干标准用超纯水重悬制备成1.0μg/μL溶液，之后用PKH26红色荧光检测试剂盒来标记。染色前，溶于Diluent C的PKH26在超纯水水浴锅于37℃孵育15min。对于对照样品，用不含颗粒的DPBS来替代外泌体标准。

① 染色流程A

PKH26用100μL diluent C稀释使其终浓度为8μM（染料浓度）。之后10μg外泌体（in 20μL DPBS，MKBio）用80μL diluent C稀释，加入染料溶液内，孵育5min，同时用枪轻轻混匀。用100μL不含外泌体的10% FBS (in DMEM，MKBio)来结合多余的染料。之后，外泌体用1ml DPBS稀释，4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

② 染色流程B

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到2ml DPBS，转移到Vivaspin20 300-kDa MWCO filters，于4°C（4000×g）离心3min，之后用2ml DPBS清洗3次，最终用沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

③ 染色流程C

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到10ml DPBS，置于2ml 20%蔗糖（in DPBS，，MKBio）的上层。外泌体用4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

④ 染色流程D

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到400μL DPBS，置于20%~60%非连续蔗糖梯度（in DPBS）的上层。外泌体用4°C超速（100000×g，MKBio）离心18h。分层3-6（密度范围1.08–1.15g/mL）吸在一起，分层7-10（密度范围1.17–1.23g/mL）吸在一起，每一份都稀释到30ml DPBS。外泌体用4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

Fig. 1. Schematic representation of staining procedures used to label exosomes with PKH26 dye. Exosomes (exo) were labeled using staining procedures based on ultracentrifugation (procedure A), filtration through Vivaspin concentrators (procedure B), and sucrose cushion (procedure C) and sucrose gradient (procedure D) purification. Key differences between the procedures are highlighted by the green text.

◇◇ 外泌体检测（Confocal microscopy）

取小体积（6μL）轻轻混匀的PKH26标记对照和外泌体样本分别转移到包被有10%多聚L-赖氨酸的盖玻片上，然后封固在载玻片上，然后转移到共聚焦显微镜下观察。用561nm diode-pumped solid state laser line观察，用565nm-605nm宽带滤片来检测发射光。

◇◇ 外泌体染色结果分析

针对几种染色流程，发现①超速离心为基础的外泌体染色会产生大量的PKH26纳米粒子（nanoparticles），直径类似于PKH26标记的外泌体。②基于过滤（filtration）为基础的外泌体染色法典型的特征是PKH26标记颗粒的回收率低。③通过蔗糖缓冲层纯化的PKH26标记纳米粒子和PKH26标记外泌体根据大小能区分开。④PKH26标记纳米粒子和PKH26标记外泌体通过进入浓缩蔗糖梯度层能分开。

摘自资料2）来自网络资源。

PKH染料（常用的有PKH26-MX4021和PKH67）大量文献用来标记外泌体和胞外囊泡进行体外和体内示踪实验。以下步骤可参考用于外泌体标记以进行微囊泡示踪实验。

外泌体标记步骤：

（1）利用超速或微过滤的方式制备新鲜的外泌体沉淀。

（2）超速离心机冷却到2-8℃。将每个样本的多管离心沉淀聚合在一起，之后测定总体积。

（3）用Diluent C, MX4022将所有体积的沉淀稀释到高达1ml。

（4）确定最大体积的沉淀样本，加等体积的不含外泌体的培养基到一个新管内，用Diluent C稀释到1ml。

（5）加6μLPKH26到1ml Diluent C管内（步骤3和步骤4）。

（6）用枪连续性轻轻混匀30s。室温静置5min。

（7）加入含2ml 10% BSA（in PBS）来淬灭反应。用无血清培养基定容体积到8.5ml。

（8）制备0.971M的蔗糖溶液。用枪缓慢吸取1.5ml蔗糖溶液，加到管子底部，确保不会产生震荡。外泌体-PKH26 MX4021标记溶液加在蔗糖缓冲层（sucrose cushion）的上方。

（9）于2-8℃超速（190,000 G）离心2h。「注意：外泌体在沉淀内，绝大部分多余的染料在中间层」。小心吸取培养基和中间层。

（10）轻轻用枪将外泌体沉淀重悬在1X PBS。

（11）转移到Amicon 10kDa MWCO超滤管内。加9ml PBS，0.75ml培养基。

（12）于3000 x g离心40min，使得最终保留体积在0.5-1mL。

（13）从Amicon超滤管内吸取浓缩液，保存在冰上。尽快于合适的仪器下分析荧光信号。

引用文献：

[1]Yu Mengyu et al. Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells. Cancer Science. 2019;110:3173–3182.

Targeted exosome‐encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells.

To quantify the amount of erastin@FA‐exo and erastin@exo taken up by MDA‐MB‐231 cells, lipophilic fluorescent dye PKH26 (MaoKang Biotechnology) was used to stain the exosomes. To detect the effect of FA receptor binding on cell uptake, culture medium containing 1.1 mg/mL of free FA was added to MDA‐MB‐231 cells to competitively inhibit FA receptors. After incubation for 6 hours, the cells were washed with PBS 3 times.Then erastin@FA‐exo was added and the cells’ uptake of the drug was observed.

[2]Yanlin Wang et al. Microfluidic Raman biochip detection of exosomes: a promising tool for prostate cancer diagnosis. Lab Chip, 2020,20, 4632-4637 https://doi.org/10.1039/D0LC00677G

PKH26 was obtained from Maokangbio Co., Ltd (Shanghai, China).