Calcein AM/PI Double Stain Kit 活细胞/死细胞双染试剂盒

产品关键词：

Calcein, AM 钙黄绿素AM；Calcein Red 钙黄绿素红；活细胞染色探针；Fluorescein diacetate (FDA)；Propidium Iodide (PI) 碘化丙啶；CAS NO：148504-34-1；

产品信息

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产品描述

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。另外，使用Calcein, AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein, AM仅对活细胞进行标记，这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。常常与碘化丙啶PI联合使用，因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞的DNA双螺旋区域，并产生红色荧光（Ex/Em= 535nm/617nm），仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特点，Calcein, AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。

本试剂盒就是结合Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据试剂盒优化体系，单次以200µl细胞悬液进行染色，分别可做500次（货号：MX3012-500T）和1000次（货号：MX3012-1000T）检测。

试剂盒组分

保存与运输方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、试剂准备

1.1 1×反应缓冲液（Assay Buffer）的配制

从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1）   先将低温保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室温回温至少20min，使其充分融化。【注意：第一次使用时建议对储存液根据单次用量分装，特别是Calcein AM，以减少反复冻融次数。】

2）   取5µl Calcein AM溶液 (4 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。【注意：染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。】

二、染色步骤

2.1  对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3min）。

对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。

2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

2.3  用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为1×105~1×106细胞/ml。

2.4  取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延长孵育时间至30min。】

2.5  荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

【注意】：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a)  用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；

b)  用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

c)  用0.1-10µM的Calcein AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

测定方法与结果呈现

1）  荧光显微镜（Fluorescent Microscopy）

检测方法：490±10 nm激发能同时看到呈黄-绿色荧光的活细胞和红色的死细胞。另，545nm激发可能只能看到呈红色的死细胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 荧光酶标仪（Fluorescent Plate Reader）

检测方法：96孔透明底的黑色酶标板（96-well black plate with clear bottom），Calcein检测的激发波长为490nm，发射波长为520nm；PI检测的激发波长为530nm，发射波长为617nm；

3） 流式细胞仪（Flow cytometer）

检测方法：流式细胞仪，Calcein检测的激发/发射波长为488/535nm，PI的激发和发射波长为488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常见问题

1、  该试剂盒适用任何细胞类型？

基本上适用于任何含酯酶活性的动物细胞。植物和细菌细胞因含有细胞壁，Calcein-AM不能进入因此无法染色。有可能对原生质体进行染色。

2、  用相同浓度有可能对所有哺乳动物细胞进行染色？

对所有细胞都用相同的浓度是很不合理的。Calcein-AM和PI的最佳工作浓度根据细胞类型差异很大。有必要根据具体细胞来确定最佳染料浓度。参考说明书染料工作浓度优化方法。

3、  Calcein-AM对细胞有毒？

与其他相似的活细胞染料比较，Calcein-AM基本无毒（毒性最小）。见文献EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

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文献引用：

[1]

Zhang XX et al. Characterization and property of dual-functional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of current density. Journal of Alloys and Compounds Volume 810, 25 November 2019, 151893

After the formazan was dissolved by dimethyl sulfoxide (DMSO), the optical density (OD) was then determined using enzyme-labeled instrument (iMark, BIO-RAD, US) at the wavelength of 570 nm. To reveal the viability of adherent MC3T3-E1 cells, a Live/Dead Double Staining Kit (MKBio, China).was employed. After 1 day culture, ... stained with Calcein acetoxymethyl ester (Calcein AM) and propidium.

[2]

Zheying Meng et al. Marriage of Virus-Mimic Surface Topology and Microbubble-Assisted Ultrasound for Enhanced Intratumor Accumulation and Improved Cancer Theranostics.

Calcein-AM and PI were purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

[3]

Xijian Liu et al. Facile synthesis of biocompatible cysteine-coated CuS nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for cancer therapy. Dalton Trans., 2014,43, 11709-11715

Calcein AM/propidium iodide (PI) double stain kit, propidium iodide(PI), and fluorescein isothiocyanate (FITC) were purchased from Shanghai Maokang