膜电位荧光探针产品专题（Probes for Membrane Potential）

（线粒体膜电位、细胞质膜电位）

▶ 快速响应荧光探针（Fast-response fluorescent probes）

代表性：ANEP染料，RH染料

▶ 慢速响应荧光探针（Slow-response fluorescent probes）

代表性：短链碳菁类染料，JC-1染料，罗丹明123染料，DiBAC染料

专题关键词：

Potentiometric probes 电位探针；Membrane Potential 膜电位；Hyperpolarization 超极化；Depolarization 去极化；Fast-response 快速响应；Slow-response 慢速响应；

一个细胞典型的质膜跨膜电位约为70mV（胞内为负电荷）。膜电位的增加和降低，分别称为膜超极化（Membrane hyperpolarization）和去极化（Membrane depolarization），在许多生理过程中发挥关键作用，包括神经冲动的传播、肌肉收缩、细胞信号和离子通道门控。电位探针（Potentiometric probes）是用来研究这些过程的重要工具，以及用于线粒体观察（线粒体的跨膜电位约为150mV，内部基质呈负电荷），用于评估细胞活力，和用于候选新药的高通量筛选。

电位探针（Potentiometric probes）包括阳离子或两性苯乙烯染料，阳离子碳花菁和罗丹明，阴离子氧鎓醇。染料的归类确定因素包括在细胞的聚集方式、反应基制和毒性。根据这些染料的光学反应、光毒性，与其他分子的相互作用，来选择合适的电位探针满足特定的用途。根据染料的光学反应可将其分为两大类：

一、快速响应探针（Fast-response probes）

1.1 工作原理

快速响应探针（通常为苯乙烯吡啶盐染料）通过电子结构的变化引起荧光特征变化来工作，对周围的电子场变化做出反应（见图MK1）。在兴奋细胞中其光学反应足够快以检测瞬时电位变化（毫秒ms），包括单一神经元、心肌细胞和完整大脑。然而，它们电位依赖性的荧光变化数量级通常很小。快速响应探针通常情况每100mV产生2-10%的荧光变化。

图MK1. 膜电位敏感探针的反应基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速响应探针经历电子场驱动的分子内电荷分布变化，从而产生对应的光谱特征或荧光强度变化（本图通过颜色标示变化来阐述）。慢速响应探针是亲脂性阴离子（本图）或阳离子通过电泳机制转跨膜转运。荧光变化与跨膜重新分布相关（本图通过颜色标示变化来阐述），归因于探针对胞内和胞外环境的敏感性。因此，电位反应速度直接体现基础过程所需的时间常数——电子的快速分子内重新分布&完整分子相对较慢的跨膜运动。

1.2 快速响应探针种类

◇ ANEP染料

ANEP (AminoNaphthylEthenylPyridinium)染料由Leslie Loew和同事开发，是最灵敏的快速响应探针。两性离子的di-4-ANEPPS（MX4038）和di-8-ANEPPS（MX4039）在各种组织、细胞和模型膜系统中表现出相当一致的荧光变化速率（10%荧光变化/100mV）。ANEP染料毫秒级的时间特征弥补其中等响应振幅（见图MK2）。di-4-ANEPPS（MX4038）非常快速被细胞内在化，阻止其用在除极短期实验之外的应用中，然而，di-8-ANEPPS（MX4039）能更好的保留在质膜的外层。另外，虽然两种染料都具有良好的光稳定和低毒性，报道提及di-8-ANEPPS（MX4039）比di-4-ANEPPS（MX4038）具微好的光稳定性和显著更低的光毒性。

与其他的苯乙烯染料相似，ANEP染料在水溶性溶液内基本无荧光，呈现的光谱特征强烈取决于所处环境。与磷脂小体结合后，di-8-ANEPPS（MX4039）最大吸收/发射波长约为467/631nm，相对在甲醇内的最大激发/发射约为498/713nm。di-4-ANEPPS（MX4038）结合到神经膜的最大激发/发射波长约为475/617nm。

di-8-ANEPPS（MX4039）和di-4-ANEPPS（MX4038）两者皆对膜电位（超极化）增加做出响应，~440nm激发处荧光降低，而530nm处激发荧光增加。这些光谱的迁移允许使用比率法来关联化膜电位与荧光信号变化。

图MK2. 使用快速响应探针di-4-ANEPPS检测兔完整心脏的动作电位（Detection of action potentials in intact rabbit hearts using the fast potentiometric probe di-4-ANEPPS）。Excised rabbit hearts were loaded with di-4-ANEPPS by perfusion with dye-containing medium. Fluorescence was excited at 488 nm by an argon-ion laser. Emission components at 540 ± 6 nm (green) and >610 nm (red) were detected simultaneously by two photomultipliers (panel A). The ratio of the green to red signals (panel B) displayed a larger fractional change during action potential cycles than either of the component signals; it also followed transmembrane voltage contours recorded simultaneously by an intracellular microelectrode (panel C). In addition, fluorescence ratio measurements reduce the motion artifacts that typically distort optical signals detected from contracting hearts. Figure reproduced with permission from Am J Physiol Heart Circ Physiol (2000) 279:H1421.

◇ RH染料

最先由Rina Hildesheim合成，RH染料包含一系列dialkylaminophenylpolyenylpyridinium染料，主要用于神经元的功能成像。大量RH染料类似物的存在反映一种现象就是没有一种单一染料能提供所有实验条件需要的光学反应。目前，最广泛使用的RH染料是RH 237（MX4017）、RH 414（MX4019）、RH 421（MX4018）和RH 795（MX4020）。不同类似物染色的生理效应并非完全相同。例如，用RH 414（MX4019）染大脑皮层引起动脉收缩，用RH 795（MX4020）则不会。体外对海马脑片或体内对猫和猴子视觉皮质（单细胞记录）进行检测，RH795产生可忽略的副反应。

与ANEP染料相似，RH染料对膜电位变化做出反应，产生可变程度的荧光激发和发射光谱迁移。它们的吸收和荧光光谱也强烈取决于所处环境。RH414结合到磷脂小体上的光谱类似于神经元质膜上的。结合使用RH染料和荧光钙离子指示剂允许同时对膜电位（RH237,MX4017）和胞内钙离子（Rhod-2 AM，MX4507）进行心肌单细胞层的成像检测。

1.3 懋康生物（MKBio）快速响应探针特征和应用汇总

1.4 懋康生物（MKBio）快速响应探针产品信息

二、慢速响应探针（Slow-response probes）

2.1 工作原理

慢速响应探针根据跨膜分布表现出电位依赖的变化，随之是荧光的变化（见图MK1）。

图MK1. 膜电位敏感探针的反应基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速响应探针经历电子场驱动的分子内电荷分布变化，从而产生对应的光谱特征或荧光强度变化（本图通过颜色标示变化来阐述）。慢速响应探针是亲脂性阴离子（本图）或阳离子通过电泳机制转跨膜转运。荧光变化与跨膜重新分布相关（本图通过颜色标示变化来阐述），归因于探针对胞内和胞外环境的敏感性。因此，电位反应速度直接体现基础过程所需的时间常数——电子的快速分子内重新分布&完整分子相对较慢的跨膜运动。

2.2 慢速响应探针种类

◇ 碳花菁染料（DiI, DiS and DiO Derivatives）

带短烷基尾（<7个碳原子）的DiI，DiS和DiO属于第一代开发的电位荧光探针。这些阳离子染料聚集在超极化的膜上，然后转运进入脂质双分子层。聚集进入封闭的膜内部通常引起降低的荧光，虽然变化幅度和荧光反应的方向强烈取决于染料浓度和染料的结构特征。

DiOC6(3) (MX4009) 是最广泛使用的膜电位测定用碳花菁染料，紧随其后的是DiOC5(3) (MX4032) 。流式测定中，碳花菁荧光强度的测定不仅取决于膜电位，也受细胞大小影响。某些情况下，前散射荧光的测定通常用来标准化细胞大小变量引起的光学变量。荧光比率法采用DiOC2(3) (MX4008) 在发射光谱内的电位依赖红光迁移来测定细菌膜电位（见图MK3）。碳花菁染料，特别是thiacyanines（比如DiSC3(5)，MX4033 ），能抑制呼吸，因此可能具有相对细胞毒性。

图MK3. 金黄色葡萄球菌菌群经30µM DiOC2(3)染色的双色流式分析图（Two-color flow cytometric analysis of Staphylococcus aureus populations stained with 30 µM DiOC2(3) in the presence (red) or absence (blue) of the metabolic uncoupler CCCP. N ote the variability (~100-fold range) of the green and red fluorescence intensities. B) The same data expressed as red/green fluorescence intensity ratios. Ratio values are calculated by subtracting the logarithmic green fluorescence channel value from the corresponding logarithmic red fluorescence channel value.

◇ JC-1和JC-10

JC-1 (MX3203)在低浓度或低膜电位下呈绿色荧光单体，然而，在更高浓度（水溶性浓度＞0.1uM）或更高电位，形成红色荧光的J-聚集体（J-aggregates），具宽激发光谱和非常窄的发射光谱。由于J-聚集体形成的增加与一定范围内（30-180mV）膜电位的变化呈线性关系，这一现象则可被电位测定所采用（见MK4 JC-1工作原理示意图）。相对于质膜，JC-1更特异性识别线粒体膜电位。比其他的阳离子染料比如DiOC6(3)和罗丹明123，去极化响应的持续性更好。

各种类型的比率测定都可进行，通过组合绿色荧光JC-1单体（Ex/Em~514/529nm）和红色荧光J-聚集体（Ex/Em~585/590nm），后者能在485nm-最大吸收波长的范围内被有效激发。用于检测荧光素（FITC）和四甲基罗丹明的光学滤片能分别用来检测单体和聚集体形式。另外，两种形式能同时用荧光素长通光学滤片设置来检测。对于流式检测，JC-1能用488nm激发，通过二元模式分别用绿色通道检测单体和红色通道检测J-聚集体。

JC-1普遍用于检测凋亡细胞的线粒体去极化（JC-1线粒体膜电位检测试剂盒，MX3204-100T）和分析多药耐药细胞。也常用来评估基于细胞高通量测定的线粒体功能评估。JC-10是JC-1的升级版本，荧光特征类似于JC-1，探针本身具更好的水溶性。

图MK4. JC-1进入线粒体和生成J-聚集体的示例流程图（Schematic illustration depicting JC-1 entry into the mitochondria and the generation of J aggregate）。JC-1，阳离子碳菁类染料（绿色）以膜电位依赖形式聚集在线粒体并开始形成J-聚集体（红色）。当发生去极化，仍保持单体形式，呈绿色荧光。（文献来源：Sivandzade F et al. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1). PMID: 30687773）

◇ Rhodamine 123, TMRM and TMRE

罗丹明123（MX3208）普遍用做线粒体的结构标志物和线粒体活性的指示剂。

TMRM（MX4306）和TMRE（MX4305）分别是四甲基罗丹明的甲酯和乙酯形式，结构非常类似于罗丹明123。主要用作线粒体膜电位感应器。与罗丹明123（MX3208）一样，这些阳离子染料聚集在线粒体，由于自淬灭荧光减弱。TMRM（MX4306）和TMRE（MX4305）比罗丹明123能更快的穿过质膜，它们的强荧光允许使用低浓度的探针，从而避免探针聚集。大鼠心肌细胞，TMRM（MX4306）与X-rhod-1 AM同时使用共聚焦成像线粒体膜电位和钙离子。活细胞内TMRE（MX4305）成功用于高通量筛选影响线粒体膜电位的药物。

◇ DiBAC（Bis-Oxonols）

三种双巴比妥酸氧鎓醇，通常统称为DiBAC染料，形成一个光谱与众不同的的电位探针家族，最大激发波长约为490nm（DiBAC4(3) (MX4029) ），530nm（DiSBAC2(3) (MX4030)）和590nm（DiBAC4(5) (MX4031) ）。有几篇文章简单定义这些染料为双氧鎓醇（bis-oxonol），则总是很难确定到底用的是哪一种染料。不过，大量使用双氧鎓醇（bis-oxonol）的文章使用的主要为DiBAC4(3) (MX4029)。

这些染料进入去极化细胞，与胞内蛋白或膜结合，表现处荧光增强和红光迁移。去极化越高，内流进入细胞的阴离子染料越多，则荧光增加。相反，超极化随之而来的是荧光降低（图MK5）。与阳离子碳菁类染料相反，阴离子双氧鎓醇大体被线粒体排斥，主要对细胞质膜电位敏感。DiBAC4(3) (MX4029)产生的电位依赖荧光变化典型为~1%/mV。阴离子氧鎓醇和阳离子K+-缬氨霉素复合体之间的相互作用使得在校准电位反应时用此离子载体变得复杂化。氧鎓醇类染料对各种离子通道和受体呈现出已知的药理活性。因此，在使用这些荧光探针的任何实验的情况下，都需要确定实验本身得到的生理效应与外用加入探针浓度是无关联的，这一步骤十分重要。

图MK5. Detection of ATP-sensitive potassium (KATP) channel activation in isolated capillaries from guinea pig hearts using DiBAC4(3), a slow potentiometric probe. Application of a K+ channel opener (HOE 234) induced membrane hyperpolarization, resulting in a net efflux of intracellular DiBAC4(3), which is registered as a decrease of fluorescence intensity. These effects were reversed by subsequent treatment with the channel blocker glibenclamide.（文献来源：Langheinrich U et al. Hyperpolarization of isolated capillaries from guinea-pig heart induced by K+ channel openers and glucose deprivation. J Physiol. 1997 Jul 15;502 ( Pt 2):397-408. PMID: 9263919）

2.3 懋康生物（MKBio）慢速响应探针特征和应用汇总

2.5 懋康生物（MKBio）慢速响应探针产品信息

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—Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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