Probes for reactive oxygen species（活性氧ROS探针）技术专题
Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基荧光素
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羟苯基荧光素
专题关键词：
Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物质；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；
基本描述：
氨基苯基荧光素（APF）和羟苯基荧光素（HPF）是由T. Nagano开发的两种活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示剂，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更优秀的特异性和稳定性。APF和HPF显示有限的非选择性反应，和相对较高的光诱导氧化抗性。APF和HPF具细胞膜渗透性，本身无荧光，直到与羟基自由基或过氧亚硝基阴离子反应，还能与次氯酸阴离子反应，产生强绿色荧光（Ex/Em，~490/515nm），可用荧光显微镜、高通量成像仪、荧光酶标板或流式细胞仪检测。
工作原理：
中性溶液中氨基苯基荧光素（APF）和羟苯基荧光素（HPF）几乎是无荧光，当与高活性氧物质（highly reactive oxygen species, hROS）反应，能够生成具有高荧光强度的荧光素（Ex/Em, 490/515nm），且能观察到荧光强度的增加【见下反应原理图】。
探针特征：
□ APF，HPF选择性检测hROS比如羟基自由基（HO•）和过氧亚硝基阴离子（ONOO–），但不会与其他活性氧物质反应（•O2–,1O2, H2O2, NO等）；
□ 通过加入辣根过氧化物酶（HRP）能定量测定过氧化氢H2O2;
□ 结合使用HPF和APF能特异性检测次氯酸（OCl-）;
□ HPF和APF本身根本不会自氧化，从而与其他试剂相比能得到更可靠的数据；
□ 能对活细胞进行成像检测；
ROS探针检测特异性比较：
□ 试剂配制：1mg HPF/APF分别溶于DMF配制成5mM储存液。使用前用磷酸盐溶液（0.1M, pH 7.4）稀释500~5000倍（10～1μM）。将稀释液加入样本并孵育，然后测定荧光值（Ex/Em, 490/515nm）。
□ 磷酸盐缓冲液体系（0.1M, pH 7.4），每一种荧光试剂（终浓度：10μM，0.1% DMF用作共溶剂）与各种活性氧物质反应。
□ HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的荧光强度测定。
表1. 活性氧探针（HPF, APF, DCFH）对各种活性氧物质的反应特异性
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ROS |
ROS产生方法 |
HPF (MX4805) |
APF (MX4804) |
DCFH (MX4802) |
|
HO• |
100 µM高氯酸亚铁(II)+1 mMH2O2 |
730 |
1200 |
7400 |
|
ONOO– |
3 µM (终浓度) ONOO– |
120 |
560 |
6600 |
|
OCl- |
3 µM (终浓度) OCl- |
6 |
3600 |
86 |
|
1O2 |
100 µM 3-(1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl)propionic acid |
5 |
9 |
26 |
|
•O2– |
100 µM KO2 |
8 |
6 |
67 |
|
H2O2 |
100 µM of H2O2 |
2 |
＜1 |
190 |
|
NO |
100 µM NOC-7 |
6 |
＜1 |
150 |
|
ROO• |
100 µM AAPH |
17 |
2 |
710 |
|
Autoxidation |
荧光光照2.5h |
＜1 |
＜1 |
2000 |
ROS探针应用示例：
示例1：细胞经光诱导的自氧化检测（Light-induced autoxidation in cells）
1.1 探针加量：37℃避光孵育细胞30min，HPF或DCFH-DA（10μM each）
1.2 荧光测定：共聚焦显微镜观察荧光（激发波长488nm，检测波长＞515nm）；488nm波长辐射刺激细胞10s，然后再测定荧光。
1.3 实验图片：
示例2：猪中性粒细胞的体内成像（Bioimaging of porcine neutrophils）
2.1 猪中性粒细胞的纯化
a）从猪血中纯化中性粒细胞；b）将纯化的中性粒细胞溶于KRPD缓冲液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上直至使用。将其转移到培养皿内。
2.2 探针加载与PMA刺激
a）加10μM HPF或APF到细胞，室温孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒细胞；
2.3 中性粒细胞的体内成像
刺激前或刺激后10min用共聚焦显微镜观察中性粒细胞（激发波长488nm，观察波长505nm-550nm）。
图. 中性粒细胞次氯酸阴离子（OCl-）检测。同时加载两个样品，一个用HPF检测，另一个用APF检测。OCl-的生成通过APF检测能看到荧光增强，通过HPF检测几乎看不到荧光变化。
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货号 |
名称 |
规格 |
价格（元） |
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1mg |
2180 |
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|
1mg |
2180 |
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50mg |
546 |
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货号 |
名称 |
规格 |
价格（元） |
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100~500T |
见站点 |
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100μl |
见站点 |
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MS5603-50ML |
tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP) 叔丁基过氧化氢溶液 |
50ml |
见站点 |
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MP5429-10MG |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸 |
10mg |
见站点 |
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50 µg |
见站点 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
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