| 目录号 | MX3008-5ML | 售价 | 425.00元 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 规格 | 5ml (500T) | 运输温度 | 冰袋 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 其他名称 | Cell Counting Kit-8 | 保存温度 | 2-8℃ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CAS号 | N/A | 有效期 | 2年 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 应用 | 细胞增殖和毒性检测 | 订购数量 |
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产品简介: Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂
产品标签 CCK-8细胞增殖及毒性检测;WST-8；MTT 噻唑兰；Alamar Blue 阿尔玛蓝；XTT；WST-1；
订购信息：高品质原料，市场供应数年，广受好评。现货供应，质量保证，欢迎来电咨询，021-54736159，QQ：2971634497。
质量控制：
产品描述 Cell Counting Kit (CCK-8)，中文名CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的一种广泛应用于细胞增殖和毒性检测的快速高灵敏度试剂盒。
WST-8是MTT（噻唑兰）的升级产品，检测原理（见下图）为：在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与活细胞数量（细胞增殖）成正比，与细胞毒性成反比。通过酶标仪在450nm波长处测定OD值来反映细胞增殖，以及细胞毒性水平。
CCK-8法应用非常广泛，包括药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
保存与运输方法 保存：2-8℃避光保存，一年有效。-20℃避光保存，二年有效。 运输：冰袋运输。
注意事项 1） 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。 2） 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。 3） 培养时间根据细胞种类不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增大细胞数量（~105个细胞/孔）。悬浮细胞比贴壁细胞较难显色，对于悬浮细胞，加入CCK-8培养1-4小时后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定来决定。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞，CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但培养30分钟左右可取出肉眼观察显色程度（根据细胞类型而定，需要摸索一定条件）。注意：CCK-8的最佳反应时间以实际显色的最佳时间为准。 4） 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。 5） 加CCK-8速度要快，减少试剂在移液器上的残留。为使CCK-8试剂和培养基充分混匀，建议在加入CCK-8后轻轻震摇培养板。为了避免加样时由于CCK-8在枪头上残留所引入的误差，可以在加样前用培养基稀释CCK-8并混匀后加样。 6） CCK-8的核心成分WST-8会与还原剂反应生成WST-8甲臢，若实验体系内含有还原剂，请务必检测背景OD值（即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8在一定时间内检测）和不加药物的培养基（只加CCK-8）进行比较。如果OD值明显偏高，则说明的确存在反应。 7） 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加入CCK-8。含酚红的培养基不影响CCK-8测定细胞活性。 8） 如果样品为高浑浊的细胞悬液，建议设定600nm（或600nm以上）作为参比波长，扣除参比波长的OD值即可。 9） CCK-8对细胞毒性非常低，其与活细胞脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加（由于脱氢酶是持续产生的）。另外，其他实验比如中兴红法或结晶紫法，也可在CCK-8检测完成后继续进行。 10）若需要测定细胞的具体数量，建议先做一个标准曲线。 11）如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。 12）关于CCK-8的更多问题，请见附录I. CCK-8使用常见问题集锦。 13）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法 1. 制作标准曲线（测定细胞具体数量） 1） 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。 2） 按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。 3） 接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）
2. 细胞活性检测 1） 在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃，5% CO2）。 2） 向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 3） 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 5） 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3. 细胞增殖-毒性检测 1） 在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。 2） 向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。 3） 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4） 向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5） 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6） 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 7） 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 【注意】：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
活力计算
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
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附录I. CCK-8使用常见问题集锦 1） CCK-8与其他细胞增殖-毒性检测方法的优势在哪里？
2） 单孔接种多少个细胞？ 当使用96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔（100μL培养基）。检测白细胞的灵敏度相对较低，因此建议接种量不低于2500个/孔（100μL培养基），建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。若使用24孔板或6孔板，请先计算每孔相应的接种量，然后按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8。
3） 如何设定空白对照？ 在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可以在不含细胞、加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。
4） 哪些物质会影响CCK-8的测定？ 当有还原性物质存在时会增加CCK-8的测定，增加OD值；当有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，降低OD值。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
5） 做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？ 有时会有影响。如果药物具有还原性就会和CCK-8发生显色反应，增加OD值。解决方法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含药物的培养基（只加CCK-8）的吸光度高，则说明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
6） CCK-8对细胞的毒性大小如何？ CCK-8对细胞毒性相当低，同样的细胞在CCK-8检测后还可用于其他细胞增殖的检测实验，比如结晶紫检测法，中性红检测法或DNA荧光检测法等。由于每种细胞对CCK-8的耐受力不同，因此若需要长时间孵育，先检测下细胞在加入CCK-8后的活力。
7） 如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？ 还可使用430-490nm之间的滤光片，但450nm滤光片的检测灵敏度最高。
8） CCK-8能否对活细胞进行染色？ 不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性四唑盐（WST-8），并通过电子载体1-methoxy PM将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK-8不能对活细胞进行染色。
9） 必须设定参比波长？设定参比波长的目的是什么？ 不一定，CCK-8在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊产生的吸收。
10）每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？ 可能存在以下几个原因：a）当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。通常情况最外一圈孔只加培养基，不作为测定孔用；b）有可能因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8，轻轻敲击培养板以帮助混匀；c）每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000~100,000个/孔范围内摸索条件。
11）如果OD值太低，可以采取什么办法？ 可采取2种办法：a）适当增加细胞数量；b）延长加入CCK-8后的孵育时间。
12）如果OD值太高，但不能减少细胞数量，如何解决？ 可以缩短加入CCK-8后的孵育时间。比如，可以把加入CCK-8后的孵育时间由原来的3h缩短到2h。
13）CCK-8显色过程种如何终止反应？ 有以下几种方法（96孔板）：a）显色反应后，将培养板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反应终止后请在24h内测定OD值。
14）必须预培养细胞吗？ 不一定。如果需要保持细胞的最佳状态，建议预培养细胞。如果不做预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。有的科研人员不做预培养，但做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
15）预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？ 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数板计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数板进行计数。
16）CCK-8对于不同的细胞灵敏度是否一样？ 不一样。悬浮细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的染色时间或增加细胞数量来解决。
17）悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？ 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。
18）应该每次做标准曲线吗？ 建议每次都做。虽然细胞相同，但是细胞状态不一样。对于状态不一样的细胞建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能有轻微的差异，此时也建议分别做标准曲线。
19）实验之前是否需要先检测以下培养基和CCK-8之间是否有反应？ 建议使用一个孔做下检测，因有时培养基种可能含氧化还原物质。正式实验之前有必要先确认下培养基和CCK-8是否有反应。一般正常的OD值应该在0.4以下。
20）有时在药物作用下，细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？ 不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反应活细胞数量。如果细胞已经死亡，即使脱氢酶的活性还有，测定出来的细胞数量将会比真实值高，不能反应真实的活细胞数量，建议采用别的方法测定。
21）可否使用384孔板进行实验？ 可以。向每孔加入培养基总体积10%的CCK-8。如果加入CCK-8体积太少，可以先将CCK-8稀释一倍，然后加入培养基总体积20%的量。
22）CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？ 有。但请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此，结果可能不同。
23）CCK-8能否检测细菌细胞？ 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向每孔100μL大肠杆菌培养液中加入10μL CCK-8，培养1-4h或过夜。
24）CCK-8的稳定性如何？ CCK-8在2-8℃能稳定保存1年，推荐用此方法检测；长期不用也可置于-20℃稳定保存2年。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。
文献引用： Liu JY et al. 3D printing of biomimetic multi-layered GelMA/nHA scaffold for osteochondral defect repair. Materials & Design Volume 171, 5 June 2019, 107708
Cell counting kit-8 reagent was purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (China). Cell proliferation on the scaffold was measured with CCK-8 after 1, 3, 5 and 7 days of culture, and cell culture plates were used as blank group. The BMSCs-seeded hydrogels were incubated in DMEM containing 10% CCK-8 protected from light at an incubator of 37 °C and 5% CO2 for 4 h, and measured at 450 nm using a microplate reader.
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