Calcein, AM 钙黄绿素（绿色，活细胞荧光探针）

（标签：超纯HPLC≥97%，50μg单支销售，普遍应用）

产品关键词：

Calcein, AM, Ultra Pure Grade 钙黄绿素（绿色）；活细胞探针；BCECF-AM；CFDA；碘化丙啶PI；细胞核探针；CAS：148504-34-1；

基本描述：

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。另外，使用Calcein, AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。

最显著特征：

只对活细胞进行染色，且细胞毒性极低，结果准确性高，是最适合的活细胞染色探针。

常与死细胞核探针碘化丙啶PI联合标记，进行活细胞-死细胞的双重染色实验。【见下：活细胞-死细胞双重染色步骤】

应用图片：

文献1：Yoshinori Hiraoka et al. Rapid Assessment of the Physiological Status of the Polychlorinated Biphenyl Degrader Comamonas testosteroni TK102 by Flow Cytometry. Appl Environ Microbiol. 2002 Apr; 68(4): 2031–2035.

图1：睾丸酮丛毛单胞菌（C. testosteroni）菌株TK102经Calcein, AM，PI双染后的荧光显微检测图片。（A）活细胞，仅有绿色荧光；（B）死细胞，仅有红色荧光；（C）透化处理细胞，中心是红色荧光，外缘是绿色荧光。

文献2：Mahto SK et al. Microfluidic shear stress-regulated surfactant secretion in alveolar epithelial type II cells in vitro. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2014 Apr 1;306(7):L672-83.

 图2: effects of fluid shear stress on cell viability. MLE-12 (i) and A549 (ii) cells subjected to a maximal flow rate of 100 μl/min for 20 min were tested for viability using fluorescent dyes, calcein acetoxymethyl (AM) in green and propidium iodide in red (see arrows).

产品特性：

1）  CAS NO：148504-34-1

2）  同义名：钙黄绿素乙酰甲酯；3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基荧光素，二乙酰甲酯；

3）  分子式：C46H46N2O23

4）  分子量：994.86

5）  纯度：≥97%（HPLC）

6）  外观：白色或浅黄色结晶粉末

7）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

8）  化学结构式：  

活细胞-死细胞双重染色步骤：

1. 储存液制备

1）Calcein, AM——若使用的工作液为2μM，那么可配制2mM的储存液（1000×），即往50μg Calcein, AM（Mw：994.86）内加入25μl细胞培养级别的DMSO（货号：MS4601-100mL）即可。-20℃干燥保存。

2）PI——用1ml去离子水溶解1mg PI，制备成1.5mM的储存液（1mg/ml in H2O）。-20℃干燥保存。

2. 染色工作液制备

取5µlCalcein-AM溶液（2 mM）和15µlPI溶液（1.5 mM）加入5ml 1× PBS或HBSS-Hepes缓冲液，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM，PI的工作液浓度为4.5μM。【注意】：由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein, AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。

3. 染色步骤

1）对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000 rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。

2）去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

3）用1× PBS或HBSS-Hepes缓冲液制备细胞悬液，使其密度为105~106细胞/ml。

4）取100µl染色工作液加入200µl细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。【注意】：如果需要，可延长孵育时间至30min。

5）在盖玻片上滴加适量染色后的细胞悬液。荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

【注意】：荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察；Calcein-AM溶液和PI溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，加入的先后顺序没有影响。

【注意】：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

1）用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；

2）用0.1-10µM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

3）用0.1-10µM的Calcein-AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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