MUG 4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸/GUS荧光底物

——转基因植物最常用报告基因GUS荧光显色底物，GUS活性定量分析

搜索关键词：β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）,蓝色荧光底物,转基因植物GUS表达, GUS活性（定量）,报告基因gusA（uidA）, X-Gluc,CAS：6160-80-1或881005-91-0

作用机制：

MUG，英文全名4-Methylumbelliferyl beta-D-glucuronide，中文全名4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸，CAS：6160-80-1或881005-91-0，一种最常用的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的荧光显色底物。GUS可水解MUG生成4-MU（4-甲基伞型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解离后在紫外光的激发下能产生蓝色荧光（Ex= 365nm，Em= 445nm）。GUS由大肠杆菌来源的报告基因gusA（uidA）所编码，经常用来检测饮用水是否受大肠杆菌污染，以及用来对血液培养制品快速鉴定细菌污染情况。MUG作为荧光底物非常适合用在植物分子遗传学研究来检测各种启动子驱动下的GUS基因表达量。MUG不仅能很好的测定植物裂解液和叶盘的GUS表达活性，且适用于全植物表达活性分析。

主要应用：

1. 转基因植物报告基因GUS活性检测，MUG用作荧光显色底物。

普遍应用优势在于：绝大多数植物细胞内不存在内源性的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高，易于定量及定性分析，能够与其他蛋白质基因融合等优势，因此，GUS基因为植物工程研究中应用最广泛的报告基因（报道基因）之一。

GUS活性检测（荧光分析法，定量研究）

GUS催化荧光底物MUG 4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸，将其水解为4-MU（4-甲基伞型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。此时用荧光分光光度计测定得到的是相对值，因此同时需要用标准物4-MU进行校准。

荧光定量分析GUS活性有两种基本方法：1）在一个时间点测定GUS酶作用产物的总荧光量，需要设定空白对照，以消除内源荧光强度；2）测定一段时间内GUS的动力学过程。在酶反应初始阶段，酶作用产物与时间呈线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无线性关系。由此可计算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白质。有时也可以用样本的鲜重来表示。

1.1 检测步骤【仅作参考，根据具体实验条件做适当调整】

a）取约100mg愈伤组织或一片新鲜叶盘于1.5ml离心管内，加入100μl萃取缓冲液（extraction buffer）内匀浆。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。

萃取缓冲液（extraction buffer）配方：50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm离心5min。收集上清转移到另一干净的1.5ml离心管，冰上放置待用。

c） 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C预热的反应缓冲液（Assay buffer）；用移液枪吹匀或漩涡混匀。

反应缓冲液（Assay Buffer）：称取17.6mg MUG溶于50ml萃取缓冲液，此时即为1mM MUG反应液。4°C保存，2周稳定。

d）在某一时间段内（高GUS活性样本30min；或低GUS活性1h-过夜；）吸取100μl溶液到含900μl终止液（Stop Buffer）的1.5ml离心管内，做好标记。有可能采集3-4个时间点和过夜孵育的时间点荧光量。【用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。】

终止缓冲液（Stop Buffer）：溶解21.2g无水碳酸钠到800ml去离子水，充分溶解，定容至1L，此时即为0.2M Na2CO3溶液。

e）以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。

2. 鉴定和分离大肠杆菌污染

本MUG琼脂培养基用来食物或药品内大肠杆菌的鉴定和分离。

2.1 按照以下步骤配制培养基，

2.2 121℃高压灭菌15min；

2.3 冷却至50℃，摇匀后倒入平板，无菌超净台内使其冷却。

2.4 结果分析：镜检发现浅蓝色荧光，表明样本受大肠杆菌（E. Coli）污染。样本涂布到平板上培养24h，镜检若是没有发现荧光，需继续培养24h，再次检测荧光以确认污染情况。

基本特性：

1）CAS NO：46160-80-1

2）同义名：4-Methylumbelliferylβ-D-glucuronide4-甲基伞型酮-β-D-葡糖苷酸；4-MUG；

3）分子式：C16H16O9

4）  分子量：352.29 g/mol（anhydrous）

5）  纯度：≥98%（HPLC）

6）  外观：白色或近白色粉末

7）  溶解性：溶于水（0.35mg/ml），溶于0.1M Sorensen’s buffer（0.1 mM）

8）  化学结构：

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注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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