microRNA（miRNA）是一类小片段单链RNA , 最初是在核内由RNA聚合酶转录形成具有帽子结构（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAA）的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其辅助因子Pasha的作用下被处理成约70个核苷的pre-miRNA。pre-miRNA被运输出核后再由另外一个核酸酶Dicer将其剪切形成约22个核苷酸的成熟miRNA。成熟的miRNA 与RISC组装成RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
图示1：miRNA的成熟过程
★ 服务内容
2：miRNA的抑制
1：miRNA 的过表达慢病毒包装
我公司采用扩增pri-miRNA及其两端的天然侧翼序列来构建miRNA的过表达质粒，并包装慢病毒。以实现miRNA在体外（内）的高表达。该方法相比化学合成的miRNA，具有可持续性表达，并且能用于难转染（例如干细胞，悬浮细胞等）细胞等优点。比pre-miRNA和mature miRNA 形式的过表达，具有表达效果更好，更能模拟体内天然的成熟过程。
我公司采用TuD RNA（Tough Decoy RNA）的设计方法构建miRNA的抑制慢病毒载体。TuD RNA不同于以往的单链RNA，它是含有颈环结构的双链RNA , 能够抵抗胞内核酸酶的降解，让miRNA抑制可持续一个月以上。并且，TuD RNA的两条链都包含一个miRNA结合位点，能够更高效地隔离浓度较低的目标miRNA。因此，相比其它方法，TuD RNA能够更长效的抑制miRNA。
图示2：TuD RNA的工作原理
3：miRNA的靶基因验证
由于miRNA是通过其seed sequence（5’端2-8位核苷酸）与靶基因的3’UTR结合抑制靶基因的表达。因此，我们将待定目的基因的3’UTR区域构建至报告基因luciferase的后面，通过比较实验组和对照组报告基因表达的改变（监测荧光素酶的活性变化）来间接反映miRNA对目的基因的抑制作用。同时结合定点突变等方法进一步确认miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。
★ 服务说明
1：客户只需提供miRBase数据库中的miRNA编号，我们就可以按照您的要求完成相关实验。
2：miRNA的过表达效果受诸多因素影响，与对照组相比，可以提高2—1000倍（如果本底表达水平较低，可以达到较好的过表达效果，如果本底表达水平较高，过表达效果会相对较低）。
3：我们提供多个microRNA慢病毒载体供客户选择（见下方载体信息）；
★ 客户所得
1：符合客户要求的产品（质粒+甘油菌 或者 病毒+polybrene）；
2：完整的电子版实验报告（包括实验材料，步骤，载体图谱等）；
3：完整的测序报告；
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载体编号 |
携带标记 |
载体骨架主要元件 |
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荧光 |
真核抗性 |
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MicroRNA过表达慢病毒载体 |
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pHY-LV-miR1.1 |
无 |
无 |
CMV-GFP-MCS |
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pHY-LV-miR1.2 |
GFP |
无 |
CMV-GFP-MCS-PGK- Puromycin |
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MicroRNA抑制慢病毒载体 |
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pHY-LV-KD1.1 |
GFP |
无 |
U6-TuD RNA-CMV-GFP |
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pHY-LV-KD1.2 |
RFP |
无 |
U6- TuD RNA -CMV-RFP |
|
pHY-LV-KD1.4 |
无 |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-Puromycin |
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pHY-LV-KD2.1 |
GFP |
无 |
U6- TuD RNA -EF1α-GFP |
|
pHY-LV-KD3.1 |
GFP |
无 |
U6- TuD RNA -UBC-GFP |
|
pHY-LV-KD5.1 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-GFP-PGK- Puromycin |
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pHY-LV-KD5.2 |
RFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-RFP-PGK- Puromycin |
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pHY-LV-KD5.4 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -UBC-GFP-PGK- Puromycin |
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3’UTR报告基因慢病毒载体 |
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pHY-LV-Report3.1 |
luciferase |
无 |
CMV-luciferase-MCS |
