专题关键词：

Reducing agents 还原剂；DTT 二硫苏糖醇；DTE 二硫赤藓糖醇；TCEP Hydrochloride 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐；GSH 还原型谷胱甘肽；GSSG 氧化型谷胱甘肽；Cleland’s reagent 克莱氏试剂；Antioxidant 抗氧化剂；GSH/GSSG；

基本介绍：

还原剂（Reducing agents）主要用于还原蛋白和多肽中的二硫键，也可用来降低蛋白聚集从而利于蛋白结晶。还原剂通常会与样本中的金属离子反应，导致还原剂性能降低。条件允许情况，可在体系中加入金属螯合剂如EDTA，以去除所有不必要的金属离子。然而，某些实验有些酶功能的激活离不开金属离子。像BME对铜离子、钴离子和许多磷酸盐缓冲液很敏感。DTT对镍离子很敏感，因此，进行镍离子相关的亲和纯化实验要注意。还原剂的种类非常多。

生物化学和分子生物学中，常用的有BME（β-Mercaptoethanol，β-巯基乙醇），二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE），和三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl），目前来说最受欢迎的莫过于DTT，已逐渐替换传统的BME；而TCEP作为新开发的还原剂，也以更佳的稳定性、更广的兼容性，和更高的还原能力，慢慢被科研工作者所重视，来替换DTT。

细胞生物学研究中，常用的为GSH（Glutathione, Reduced），一种极其重要的抗氧化剂，用以保护细胞和组织免受活性氧导致的损伤。GSH/GSSG比率是用来反映细胞和组织氧化应激的重要指标之一。

几种还原剂的特征描述：

1. 巯基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME，BME）

典型特征：只含有一个巯基，还原性最差，还原作用只能维持2-3天，挥发性强。1970年前广泛使用，由于恶臭（臭鸡蛋味），之后迅速被DTT替代。溶液中BME一旦接触空气会迅速被氧化成一个二硫化物，特别碱性pH环境。正由于这一特性，BME广泛用来保护蛋白，特别是酶，保持其活性。加入过量BME（通常0.01M）能维持蛋白巯基处于还原态。

应用：通常以5%浓度加入SDS-PAGE凝胶的上样缓冲液。裂解分子间（亚基间）的二硫键从而使蛋白质亚基在SDS-PAGE上各自分开。裂解分子内（亚基内）的二硫键使亚基完全变性，从而保证每个肽按照其链长迁移而不受二级结构的影响。

2. 二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）

典型特征：含有二个巯基，还原性强于BME，作用能维持3-7天，挥发性弱。两者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，其在pH 6.5-9.0内都具有活性。通常情况，使用DTT (100 mM)所需的浓度是使用β-ME(5% v/v, 700 mM)所需浓度的七分之一。

应用：1）用作还原剂（通常用来还原蛋白和多肽中的二硫键，防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成。）；2）用作抗氧化剂（保护活细胞免受离子辐射的伤害）；3）用作巯基化DNA的还原剂（巯基化DNA末端的硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是氧气存在情况。二聚化能明显降低后续偶联反应的效率，比如生物传感器金离子上的DNA固定化）；4）保持谷胱甘肽处于还原态；5）用作解毒剂（antidote）维持解毒系统的活性；5）参与细胞代谢比如囊泡形成，细胞形态特征，信号转导通路（激素样作用）等；6）用在如胱氨酸贮积症，或由于离子或金属毒性导致的疾病治疗过程中。

3. 二硫赤藓糖醇（Dithioerythritol，DTE）

典型特征：DTE是DTT的差向异构体（epimer），结构比较见下。

应用：同DTT，DTE也是一种优秀的还原剂，其还原性可能稍稍弱于DTT。

4. 三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）

典型特征：TCEP，还原性最强，作用可维持2-3周。pH范围广，且无臭味。且兼容性好。在很多应用大已慢慢的替代DTT。

应用：1）用作还原剂（通常用来还原蛋白和多肽中的二硫键，防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成）；2）用作许多重金属离子如Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)和Ni(II)的螯合剂。

以下表1，是对DTT&TCEP的特征和功能的一一比较：

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5. 还原型谷胱甘肽（Glutathione, Reduced，GSH）

基本描述：

谷胱甘肽（Glutathione），一种小分子巯基多肽，在人体内以两种形式存在，还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），两者在相应的生理反应和酶催化下实现转化，GSH/GSSG比率常用作反映细胞和组织氧化应激的一种重要指标。

还原性谷胱甘肽，英文名Glutathione, Reduced，缩写为GSH，CAS NO. 70-18-8，普遍存在于动植物、真菌、一些细菌和古生菌中的一种重要抗氧化剂，保护细胞免受活性氧比如自由基、氧化物和脂质过氧化物造成的损伤。GSH是一种内源性三肽，发现于生物体内最主要的一种非蛋白硫醇，可提供电子还原细胞质蛋白通过半胱氨酸残基连接形成的二硫键，维持蛋白的还原状态。此过程中GSH也被氧化为GSSG。之后，通过谷胱甘肽还原酶（GS）的作用，以NADPH为电子供体，GSSG又被还原为GSH。GSH具有多种代谢、调控和保护功能。还可用作乙二醛酶I的抑制剂。

应用：

GSH用作还原剂，主要的功能也体现在细胞培养系统中。见下：

1. 保护细胞免受氧化应激带来的损伤，使得胞内和胞内都保持在一种良好的氧化还原状态。提供还原当量再生巯基化合物和抗氧化剂，同时转化过氧化物到水或醇中。氧化型谷光氨肽（GSSG）能被谷胱甘肽还原酶快速还原，在正常的体内或者血清中几乎没有氧化形式的GSSG存在。

2. 谷胱甘肽是许多硒化蛋白的首选底物，在胞内和胞外环境起到解毒功能，通过将过氧化氢转化为水，或者将有机过氧化物转化为水和有机醇。若是不能去除，这些氧化物和过氧化氢最终会形成反应性的羟基、过氧和烷氧自由基。

3. 谷胱甘肽还原胱氨酸和半胱氨酸混合的二硫化物，产生半胱氨酸。保证半胱氨酸用作一种底物以形成蛋白，以及谷胱甘肽。

4. 谷胱甘肽再生抗血酸盐，一种重要的维生素，参与铜离子动员，细胞贴壁，氨基酸代谢和抗氧化。间接有利于维持细胞膜的抗氧化活性。

5. 谷胱甘肽通过谷光氨肽S-转移酶的作用，对脂质过氧化和/或糖氧化过程中产生的醛类进行解毒；

6. 谷胱甘肽可能用作一种非毒性和稳定的半胱氨酸储存池，以进行蛋白合成；

7. 保证胞内蛋白巯基基团的还原态，从而有利于蛋白的分泌表达；

8. 某些细胞使用特殊的氨基酸膜转运系统，其活性依赖γ-谷氨酰转移酶。谷胱甘肽是其首选底物，有利于转运其他氨基酸进入细胞。

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注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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