搜索关键词：Bovine Hemoglobin 牛血红蛋白；Protease substrate 蛋白酶底物；oxygen transporter携氧蛋白；血红素 heme；Fe2+；Fe3+；sickle-cell anaemia ( SCA ) 镰刀形红细胞贫血症；CAS NO：9008-02-0；

基本描述：

血红蛋白（Hemoglobin，Hb，CAS NO.9008-02-0），是红细胞中的一种主要成分，决定细胞的红色程度，正常含量为34%。血红蛋白是脊椎动物内最重要的呼吸蛋白，因其能够将O2从肺部转运到身体组织，并且返运CO2到肺部，维持血液酸碱平衡。血红蛋白用作O2运输者，Fe2+/Fe3+平衡是血液氧化程度的生理指标。脱氧血红蛋白将亚硝酸盐还原一氧化氮（NO），加强血液流到缺氧组织的一种血管舒张剂，由此，创建一种反馈回路。血红蛋白对红细胞结构维持中发挥重要作用，异常的血红蛋白结构会破坏红细胞形状，并且破坏其功能。最常引起的疾病即镰刀形红细胞贫血症。其他相关疾病有地中海贫血症（缺乏一条或更多球蛋白肽链），骨和骨髓疾病，肾病和糖尿病等。

血红蛋白结构：

血红蛋白是一种四聚体，每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在正常生理条件下盘绕折叠成球形，将血红素分子包裹在里面，这条肽链盘绕成的球形结构称为球蛋白（珠蛋白，Globin）。亚铁离子（Fe2+）含有六个配位键，其中四个结合到原卟啉IX上的四个吡咯环上的氮原子上，一个结合到球蛋白侧链中一个组氨酸残基中的咪唑氮原子上，最后一个结合其他小分子，比如O2，CO，或CO2。整个过程中血红蛋白的结构会发生变化，以促进后续分子更好的结合和释放，即协同效应。成人血红蛋白包含96.5-98.5% HbA1（α2β2）二聚物和1.5-3.5%HbA2（α2d2二聚物），其中，α, β和d代表不同氨基酸序列的亚基。

血红蛋白命名规格（各种类型）：

1、高铁血红蛋白（Ferrihemoglobin），也称为methemoglobin，指的是含有三价铁离子（Fe3+）的血红蛋白；

2、亚铁血红蛋白（Ferrohemoglobin），也称为还原性血红蛋白（reduced hemoglobin），指的是含有亚铁离子，还原态的血红蛋白。血红蛋白必须处于还原态，才能结合O2或其他分子：

a，氧基血红蛋白（Oxyhemoglobin，HbO2）含有结合的氧O2；

b，脱氧血红蛋白（Deoxyhemoglobin，Hb）未结合O2；

c，羧基血红蛋白（HbCO）含一氧化碳CO，替换O2。其对CO的亲和特性约是O2的325倍。

基于血红蛋白的蛋白酶活性检测（比色法，Enzymatic Assay of PROTEASE，仅作参考）：

1、试剂准备

a，50 mM Potassium Phthalate Buffer, pH 2.8 at 37°C

溶解4.03g邻苯二甲酸氢钾于100ml去离子水，然后加入53ml 200mM HCl。37°C，用1M HCl调整pH到2.8。之后定容到400ml。

b，2.5%（w/v）血红蛋白溶液

溶解2.5g血红蛋白粉末（MP6111）于70ml去离子水。然后加入20ml 0.5M HCl，37°C用1M NaOH调整pH到2.8。最后用去离子水定容到100ml。【注意】：血红蛋白溶解非常缓慢，如一次性加入很多会聚集在一起。

c，110 mM三氯乙酸溶液(TCA)

取9ml TCA（6.1N溶液，约100% w/v），用去离子水稀释到500ml。

d，Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent (F-C)福林酚试剂：稀释10ml福林酚试剂（F9252，sigma）到40ml去离子水。

e，500mM碳酸钠溶液

f，1.1 mM L-酪氨酸标准溶液：溶解L-酪氨酸（sigma，T3754）到100ml去离子水，低温加热助溶（不可煮沸）直至完全溶解，然后冷却到室温。

g，蛋白酶溶液：使用前制备，用冷的试剂A溶解蛋白酶，浓度0.5-1.0 unit/ml。

2、步骤

吸取以下试剂到合适的管子内：

3、生色反应

标准曲线：吸取以下试剂（剂量单位：ml）到合适的管子内

检测样品：吸取以下试剂（剂量单位：ml）到合适的管子内

4、计算

标准曲线：ΔA660nmStandard=A660nmStandard -A660nmBlank，以ΔA660 standard为纵坐标，µmoles酪氨酸为横坐标，建立曲线。

样品确定：ΔA660nmSample=A660nmTest -A660nm TestBlank，根据标准曲线来确定释放所得到的µmoles酪氨酸量。

Units/ml enzyme=【(µmole Tyrosine equivalents released) (16)】/【(1)(10)(2)】                                   

16 = Total volume (in milliliters) of stopped reaction

2 = Volume (in milliliters) used in Colorimetric Determination

1 = Volume (in milliliters) of enzyme used

10 = Time of reaction (minutes) as per the Unit Definition

Units/mg solid=【 units/ml enzyme】/【mg solid/ml enzyme】 

5、单位定义

One unit will hydrolyze hemoglobin to produce color equivalent to 1.0 µmole (181 µg) of tyrosine per minute at pH 2.8 at 37°C (color by Folin & Ciocalteu's reagent).

6、最终反应浓度（Final assay concentration）

In a 6.00 ml reaction mix, the final concentrations are 8.3 mM potassium phthalate, 2.1% (w/v) hemoglobin, and 0.5 - 1.0 unit protease.

7、文献引用

Yoshida, F. (1956) Bull. Agr. Chem. Soc. Japan 20, 252- 256.

血红蛋白基本特性：

1）  CAS NO：9008-02-0

2）  英文同义名：Bovine Hemoglobin; HGB; Hb; Ferrohemoglobin;

3）  中文同义名：血红蛋白，来源于牛血；牛血红蛋白；

4）  分子量：~64500 Da

5）  金属含量：0.25-0.35%（Fe）

6）  外观：红色至棕色粉末

7）  溶解性：溶于水（20 mg/ml）

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