HT115(DE3) Chemically Competent Cell  大肠杆菌化学感受态细胞

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HT115(DE3)；RNAi feeding strain RNA干扰喂养菌株；线虫RNAi；Nematode Growth Medium (NGM)线虫培养基；C. elegans秀丽隐杆线虫；

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菌株描述

HT115(DE3)菌株是一种RNAi饲养菌株，具四环素抗性，能在37℃，LB培养基上进行有氧生长。主要用于线虫的干扰实验。

HT115(DE3)菌株是一种特殊的RNase III缺陷型大肠杆菌菌株，此菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（其上携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因，在IPTG的诱导下表达T7 RNA聚合酶，进而启动线虫dsRNA的表达），除了用于线虫RNAi干扰实验，也适用于靶基因克隆进入T7启动子表达载体比如pET系列的蛋白表达。

HT115(DE3)菌株基因型：E. coli [F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus) ]

产品描述

本品是大肠杆菌HT115(DE3)菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达5×107 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞必须用干冰运输，感受态细胞应在-80℃保存。

2） 感受态细胞最好在冰上融化，不可在冰上放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

3） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5） 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6） 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

7） 诱导时，IPTG浓度范围可选：0.1~10mM。

8） 为了进行干扰质粒中dsRNA的生成，HT115(DE3)菌株需在特殊的RNAi NGM（Nematode Growth Media）平板上培养，添加有IPTG和氨苄（50µg/ml）或羧苄（25µg/ml）抗生素，倾向于用羧苄应其更稳定。

9） 为了得到足量的蛋白，需就最佳诱导时间、温度、IPTG浓度进行优化。

10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1） 从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物），用手轻弹管底轻轻混匀（避免用枪吸打），冰浴静置25min。

2） 42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

3） 向每个离心管中加700 μl无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4） 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取50μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含所选质粒筛选抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养过夜。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（5000 rpm，1min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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附录I 蛋白诱导步骤（仅作参考）

1）从新鲜涂布平板上挑取一单克隆，转移到含相应抗生素的5ml LB液体培养基内。

2）37℃，200rpm摇菌培养过液。

3）将步骤2）中过夜培养的菌液吸取0.5ml接种到含相应抗生素的50ml LB液体培养基内（建议使用500ml三角瓶培养）。

4）37℃，150rpm摇菌培养直至OD600达到0.6~0.8（建议0.6，约2.5h）。

5）【可选】用移液枪吸取1ml培养物到干净的离心管内，置于冰上直至用于凝胶分析或保存在-20℃。这是非诱导的对照样本。

5）加入IPTG使其终浓度为1mM。目的蛋白的最佳诱导时间可能在2~16h，依蛋白而异。

6）37℃，120rpm培养2~4h。为了确定目的蛋白的最佳诱导时间，建议作一个时间周期优化实验，范围从2~16h。

7）将培养物冰浴10min。4℃，5,000 x g离心10min收集菌株。

8）吸掉上清，将沉淀保存在-20℃（也能保存在更低的温度）。

IPTG母液（1M）配制

称量2.38g IPTG（Mw: 238.30）溶于适量去离子水，充分溶解后，调整终体积到10ml，并过滤除菌，即得到1M ITPG母液。

                                                                                               — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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