目录号 | MX3214-100T | 售价 | 2950.00元 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
规格 | 100T | 运输温度 | 冰袋运输 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
其他名称 | 保存温度 | 2-8℃保存 不可冰冻。其中组分A,B需避光保存 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAS号 | N/A | 有效期 | 1年 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
应用 | 细胞凋亡检测 | 订购数量 |
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
产品简介: Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit 细胞凋亡检测试剂盒 产品信息
产品描述 Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit)是一款用来检测细胞凋亡的试剂盒,可以用流式细胞仪进行检测。本试剂盒包含APC标记的Annexin V,用来检测早期细胞凋亡;以及7-氨基放线菌素D(7-AAD),用来检测坏死细胞。
本试剂盒的工作原理在于:磷脂酰丝氨酸(Phosphotidylserine,PS)是一种带负电荷的磷脂。正常细胞中,PS位于细胞膜内面,但当凋亡开始后,PS在磷脂双分子层中的不对称分布逐渐消失并转移到细胞膜表面,从而暴露在细胞外环境中。膜联蛋白V(Annexin V)是一种分子量约35kDa的钙离子依赖性磷脂结合蛋白,能非常容易的结合PS,且具有高度的亲和性。因此,通过Annexin V与PS的结合与否来判断凋亡发生。另外,7-AAD的引入能辅助区分凋亡早期细胞和晚期凋亡或坏死细胞。7-AAD作为一种活细胞排斥探针,不能穿透具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡早期细胞,但能穿透丧失细胞膜完整性的凋亡晚期细胞或坏死细胞,从而将细胞核染红。因此,将Annexin V-APC与7-AAD联合使用时,呈现结果为:正常细胞(Annexin V-APC-/7-AAD-),早期凋亡细胞(Annexin V-APC+/7-AAD-);晚期凋亡细胞和坏死细胞同时呈现双阳性(Annexin V-APC+/7-AAD +)。
产品组成
保存与运输方法保存:2-8℃保存,不可冰冻。其中组分A,B需避光保存。1年有效。 运输:冰袋运输。
注意事项 1) 对于贴壁细胞,需要很好掌控消化步骤。细胞凋亡诱导时贴壁细胞如有漂浮细胞,需同时收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色。处理贴壁细胞时要小心,尽量避免人为造成的细胞损伤。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,导致7-AAD摄入过多;而胰酶消化时间过长,细胞膜也易造成损伤,甚至会影响细胞膜PS与Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇使胰酶与细胞充分接触,之后倒掉大部分胰酶,利用残留的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
2) 实验中不建议固定细胞,因固定过程可能导致荧光淬灭。 3) 由于细胞凋亡是一个快速过程,染色后请尽快检测,时间过长会导致凋亡或坏死细胞数量增加。
4) 若样品来源于血液,务必先去除血液中的血小板。因为血小板含有PS,会与Annexin V结合产生假阳性。可使用含EDTA的缓冲液并低速离心去除血小板,之后再用Annexin V binding buffer清洗细胞,以避免残留的EDTA螯合钙离子。 5) 荧光物质易发生淬灭,试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。
6) 7-AAD为潜在致癌物,操作时请做好防护措施,避免与皮肤、眼睛的直接接触。 7) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用方法 一、 试剂准备 1× Binding Buffer的准备:取足量5× Binding Buffer用去离子水稀释到1× Binding Buffer(比如,1ml 5× Binding Buffer加4ml去离子水稀释),混匀均匀,4℃或冰上预冷待用。 1×PBS的准备:自行配制或直接购买商业化的PBS Buffer。4℃或冰上预冷待用。
二、 仪器参数校正 2.1 收集1-3×106个细胞,用1×PBS离心清洗2次,弃上清。 2.2 加入500μl Apoptosis Inducer Control重悬细胞,于冰上孵育30min。 2.3 加入1×PBS离心清洗1次,弃上清。
2.4 加入适量1× Binding Buffer重悬,并加入等量且未经处理的活细胞,轻轻混合。用1× Binding Buffer补充至1.5ml,等分成3管,其中1管为空白对照管,另2管为单染管。
2.5 单染管分别加入5μlAnnexin V-APC或10μl7-AAD,室温避光孵育15min。 2.6 在流式细胞仪上,用空白管调节前向散射光(Forward Scatter,FSC)、侧向角散射光(Side scatter ,SSC) 和荧光通道的电压,并在此电压条件下,用单染管调节荧光通道的补偿。
三、 染色步骤 3.1 细胞样品的准备: a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果无法完全离心至管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞:1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞,如果无法完全离心至管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清,可以残留约50µl左右的培养液,以避免吸走细胞。加入1ml 4℃预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。
3.2 用1× Binding Buffer重新悬浮细胞沉淀并调整浓度为1×106-1×107个细胞/ml。 3.3 取100µl的细胞悬液到5ml流式管中,加入5µl Annexin V-APC和10µl7-AAD混匀,室温避光孵育15min。 3.4 无需清洗,每管加入385µl1× Binding Buffer,混匀,尽快(<1h)用流式细胞仪完成检测。
四、染色检测 对于Annexin V-APC(Ex=633nm,Em=660nm),用流式细胞仪的FL4通道检测;对于7-AAD-DNA复合物(Ex=546nm,Em=647nm;能被488nm激光器激发,最大发射波长为647nm),用流式细胞仪的FL3通道检测。
常见问题 1) Annexin V/7-AAD凋亡试剂盒能够用于检测人或其他动物的细胞凋亡情况? 回复:可以,因Annexin V特异性结合PS,而PS在不同种属间无差异。
2)贴壁细胞做凋亡用胰酶消化对细胞膜有损伤? 回复:低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞2~3次,4℃,1000rpm离心5min, 处理得当的话, 胰酶造成损伤可以控制在 5%以内,在有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。也可以使用非常温和的Accutase消化酶(#MX2001-100ML),能更大程度的保护细胞膜完整性。
3)贴壁细胞可先染7-AAD然后再消化吗?这样是否可减少由于消化液造成的细胞膜损伤而染上7-AAD的误差? 回复:先加 7-AAD不仅染色是否每组都均匀充分很难判断, 而且7-AAD本身对细胞也是有毒性的, 对实验结果影响会比胰酶大,不建议这样做。
4)为什么只能用不含 EDTA的胰酶消化贴壁细胞,用含 EDTA的胰酶消化细胞对结果有什么影响? 回复:因Annexin V是钙离子依赖性的磷脂结合蛋白,EDTA是一种金属螯合剂。因此EDTA的加入会影响Annexin V活性,进而影响结果。
5)Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒是否适合荧光显微镜检测? 回复:本试剂盒经流式细胞仪检测能得到理想的染色结果。对于荧光显微镜未经内部检测,理论上若荧光显微镜配有适当的滤片是可行的。研究人员可尝试使用,方法参考文献。
相关产品
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作,主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本,以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。
|