BL21(DE3) Electrocompetent Cell 大肠杆菌电转感受态细胞

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产品组分：

菌株描述

BL21(DE3)菌株来源于大肠杆菌B/r菌株，特别构建适用于重组蛋白的高水平表达。BL21(DE3)菌株缺乏lon和ompT蛋白酶，从而改进重组蛋白的稳定性。DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（其上携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因），IPTG能诱导T7 RNA聚合酶的表达。BL21 (DE3)特别适合于噬菌体T7启动子为基础的表达系统（比如，pRSET，pCR T7和pET）。

BL21 (DE3)菌株基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)

产品描述

我司（懋康生物）提供的BL21(DE3)电转感受态细胞经特殊工艺制作，适用于各种多肽、蛋白表达文库的构建，经pUC19质粒检测转化效率>1010cfu/μg DNA。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，6个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2）   整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3）   加入DNA的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。若转化大质粒或想得到较高转化效率，推荐使用高纯质粒抽提试剂盒提取质粒。

4）   为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5）   转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6）   对于连接产物的转化，大部分公司的连接体系或重组体系（比如，Thermo或NEB公司的T4连接酶体系，NEB公司的重组系统）不用纯化，能直接与BL21(DE3)电转感受态细胞混合后进行转化，需控制DNA浓度≤100ng/μl，体积≤5μl/50μl感受态细胞。过高浓度连接产物或过大体积连接产物都会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

7）   电击杯里的离子会增加溶液的电导，增大在含细胞和DNA溶液中产生电流和弧光放电的风险。

8）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1)        将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。

2)        取-80℃保存的感受态细胞插入冰中5min，待其完全融化。

3)        往50μl感受态细胞悬液中加入目的DNA（质粒或连接产物），用手拨打管底使其混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

【注意】：要测定转化效率，请使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：对于连接产物，大部分公司的T4连接酶体系或50℃重组体系不用纯化，可直接与BL21(DE3)电转感受态细胞混合后进行电击转化，需控制DNA浓度≤100ng/μl，体积≤5μl/50μl感受态细胞。

【注意】：对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系需用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液重悬，然后与电击感受态细胞混合进行电击转化。

4)        用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-DNA之后快速转移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

5)        启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐参数来操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

6)        2min后从冰中取出电击杯，放在室温，加入700 μl无抗生素的SOC培养基（室温），用枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管，向离心管内补加的SOC培养基定容至10ml。于37℃，225rpm振荡复苏培养1h。

【注意】：SOC培养基配方:2% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2,10 mM MgSO4, 20mM glucose。SOC培养基营养丰富，主要用于大肠杆菌感受态细胞转化的复苏步骤，能最大化感受态细胞的转化效率。

7)        5,000rpm离心1min，重悬后取100~200μl加到含相应抗生素的SOC平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径150mm培养皿2~5个），用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养13~17h。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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