NMY51 Chemically Competent Cell 酵母菌化学感受态细胞

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见我司（懋康生物）整理的酵母双杂交（Yeast two-hybrid assay）产品专题。

产品关键词：

Y190-GAL4酵母单杂交系统；Y1HGold；pGBKT7；pGADT7；Ar Qual；X-α-Gal；Aureobasidin A （AbA）；金担子素；

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产品组分：

产品描述

双膜系统（Dualmembrane system）是由Dualsystems Biotech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的筛选技术，该技术利用分离的泛素系统直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前为止唯一用来检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂交系统。

双膜系统利用NMY51酵母菌，能直接转化质粒进行蛋白突变验证或筛库实验。转化标志为TRP1，leu2-3。报告基因为HIS3，ADE2和LacZ。NMY51的选择性生长筛选通过营养缺陷报告基因（HIS3，ADE2）进行，之后通过LacZ报告基因进行β-半乳糖分析的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因由不同的启动子调控，有助于降低假阳性几率。

双膜系统的工作原理在于：泛素分子量很小，由76个氨基酸残基组成。泛素作为降解信号分子，能够连接另一个蛋白的N端，之后被泛素专一性蛋白酶（ubps）识别，导致与泛素相连蛋白被酶降解。泛素可人为分成两个部分：N端（Nub）和C端（Cub）。首先，将泛素Nub的三位异亮氨酸突变成甘氨酸（Nubi突变为NuBG），通过这种方式Cub的亲和力明显降低，避免Cub和Nub自我结合或靠近的可能性。其次，Cub与合成的LEXA-VP16转录激活因子融合成融合蛋白Cub-lexa-vp16。正常情况下，NuBG不与Cub结合，ubps也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将待测蛋白分别与NuBG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-lexa-vp16）和prey融合蛋白（prey-NuBG）。如果bait和prey发生相互作用，促使NuBG和Cub的相互接近，从而被ubps识别，导致LEXA-VP16的解离，进入核内，进而激活报告基因的转录。该系统能使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志是Leu。三种prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志是Trp。

本品为经特殊工艺制备的NMY51酵母菌化学感受态细胞，用pGADT7质粒检测转化效率＞104cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存三个月。

基因型

MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4

保存与运输方法

保存：其中感受态细胞按标签注明置于-80℃保存，三个月有效。其他组分按照标签注明保存，一年有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   最好在冰上融化感受态细胞。

2）   转化高浓度质粒可相应减少用于涂板的菌量。同时转化2-3种质粒可适当增加质粒的用量。

3）   NMY51对高温敏感，最适生长温度为27-30℃，一旦高于31℃，生长速度和转化率都呈指数下降。

4）   菌落变粉红色并不是污染，而是酵母细胞生长中的一种常见现象。当酵母细胞在平板上培养几天，将平板内的腺嘌呤消耗殆尽，那时酵母试图通过自身代谢途径合成腺嘌呤以供利用。然而，某些菌株ADE2基因被破坏，腺嘌呤合成受阻。且ADE4，5，6，7，8基因均正常。由此，造成中间产物P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞的积累使得菌落变为粉红色。

5）   酵母菌在缺陷培养基上生长速度比YPDA培养基慢，营养缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板于29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板于29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆；涂SD双缺平板于29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆；涂SD三缺或四缺平板于29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆；

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1）   Carrier DNA于使用前通过加热处理使其变性为单链状态，方法如下：95-100℃ 水浴或金属浴3min，快速插入冰中，静置3min。重复一次。

2）   取100 µl冰上融化的NMY51化学感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5 µg，单链Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl，用枪吹打几次充分混匀，30℃水浴30 min（在15min时翻转6-8次混匀）。

3）   之后将管子放42℃水浴15 min（在7.5min时翻转6-8次混匀）。

4）   5000 rpm离心40s弃上清，用400 µl ddH2O重悬沉淀，离心30s弃上清。

5）   用50 µl ddH2O重悬，涂板，放入29℃培养48-96 h。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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