Rosetta-gami(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

大肠杆菌化学感受态细胞

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产品标签：

Rosetta-gami；Rosetta (DE3)；Origami；表达感受态细胞；pET表达载体；IPTG诱导；毒性蛋白表达；

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产品组分：

菌株描述

Rosetta-gami菌株为Origami衍生菌，含突变的硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin Reductase, trxB）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, gor）基因，明显改善细胞质内二硫键的形成，增强蛋白的可溶性。该菌株补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AGG，AGA，AUA，CUA，CCC，GGA）对应的tRNA，位于一共存的氯霉素抗性质粒上，由天然启动子启动tRNA，提高了外源基因的表达水平。

DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因）。这种菌株适用于目的基因克隆在pET载体上的蛋白生产，由IPTG诱导表达。

pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，从而能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有卡那霉素，氯霉素，链霉素和四环素抗性，为亮氨酸生长缺陷型菌株。

Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株基因型：Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL(DE3) F´[lac+lacIqpro] gor522::Tn10 trxB::kan pLysSRARE2 (CamR, StrR, TetR)

产品描述

本品是大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输方法

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2）   最好在冰上融化感受态细胞。

3）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6）   Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，除复苏培养基不含抗生素之外，其他所用培养基、培养液都应含有氯霉素（34μg/ml），以防止质粒丢失。

7）   Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株具有卡那霉素抗性，不能用于具此抗性质粒的表达。

8）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1）  从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA，用手轻弹管底轻轻混匀，冰浴静置25min。

2）   42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min。此过程不要摇动离心管。

3）   向每个离心管中加700 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4）   低速离心收菌（比如4000rpm，2min），留取100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含氯霉素（34μg/ml）以及所选质粒筛选抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16h。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（4,000 rpm，2min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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