Stable Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞

产品标签：

Stbl3；Stbl2；HB101；Stable；Direct repeats 直接重复片段；Lentiviral expression vectors 慢病毒表达载体；Gibson Assembly 一步法克隆检测试剂盒；

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产品组分：

菌株描述

Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率的大肠杆菌菌株，特别适合分离含重复元件和不稳定插入序列的质粒克隆，也适合分离和扩繁逆转录病毒/慢病毒载体克隆。与商业化的同源重组反应体系比如NEBuilder HiFi DNA Assembly，Gibson Assembly反应体系和酶切连接体系都兼容。Stable菌株基因型与Stbl2，Stbl3没有关联性，但具有更优异的性能（见图1）。基因组含有重组酶recA1 relA1突变，能有效抑制长末端重复序列的重组，降低了错误重组的频率。还含有核酸酶内切酶endA1突变，避免了质粒提取过程中核酸酶的污染，显著提高制备质粒的产量和质量。基因组含有lacZΔM15，适用于蓝白斑筛选。菌株本身含链霉素和四环素抗性，在成功转化后赋予其额外的筛选标志。

Stable菌株基因型：F' proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC

菌株亮点

◇   Stable菌株具有很高的转化效率，经pUC19检测转化效率＞5×108 cfu/μg DNA；

◇   Stable菌株是基因克隆进入腺病毒/慢病毒载体的推荐宿主菌；

◇   Stable菌株是克隆正向重复序列和反向重复序列的推荐宿主菌；

◇   Stable菌株含recA1突变，能减少克隆DNA的重组发生，从而降低错误重组频率；

◇   Stable菌株含mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，能有效转化真核来源的甲基化DNA或PCR、cDNA和许多其他来源的非甲基化DNA;

◇   Stable菌株含endA1（非特异核酸内切酶I）突变，确保得到最高质量和产量的质粒；

◇   Stable菌株含fhuA突变，具有对噬菌体T1的抗性；

◇   Stable菌株含lacZΔM15，适用于具α-互补载体的蓝白斑筛选；

产品描述

本品是Stable菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率＞5×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

Stable与Stbl3克隆性能（错误重组率）的比较

图1. Stable与Stbl3克隆不稳定DNA序列的性能比较。pUC-5xREP含5 x 32bp 重复序列，其在普通大肠杆菌中很不稳定。酶切后线性化的pUC19片段2.2ng+1ng 5xREP DNA片段配制成重组反应体系，重组反应完成后分别转化Stable感受态细胞（A）或Stbl3感受态细胞（B），复苏60min，涂布在含50μg/ml羧苄青霉素的LB平板，30℃培养20h。之后做菌落PCR，检测5xREP DNA插入的稳定性（含有正确插入片段的克隆，菌落PCR片段为623bp）。

注意事项

1）   对不稳定DNA克隆或逆转录病毒/慢病毒载体克隆，涂板后应在30℃培养，以减少错误重组的发生概率。

2）   制备高纯度病毒质粒，需使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后使用。

3）   对不稳定的克隆或病毒质粒优先以质粒状态保存，尽量避免以转化在大肠杆菌细胞的方式保存质粒。

4）   感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

5）   最好在冰上融化感受态细胞。冰上融化时间不宜过长，长时间会降低转化效率，混入DNA需轻柔操作。

6）   进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

7）   为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

8）   产品包装内含质粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供对照实验用。

9）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1）   从-80℃取出感受态细胞迅速置于冰浴中5-10min使其完全融化。

2）   向融化的感受态细胞中加入目的DNA（1-2μl含100pg-100ng质粒DNA），用手轻弹混匀（避免用移液枪上下吹打），冰浴静置30min。

3）   42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置5min。此过程不要摇动离心管。

4）  向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于30℃ 摇床，250rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

【注意】：当质粒中含不稳定片段，30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照，需用37℃，225rpm培养60min来复苏。】

5）   提前将筛选平板拿出置于30℃孵育使其温度保持在30℃。

6）   通过轻弹管子和倒置使得细胞完全混匀后，吸取50-100μl直接加入含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上；或5000rpm离心1min，留取100μl左右吹打重悬菌体，吸取适量加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上；之后用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或30℃）直至液体被吸收，倒置培养，30℃培养20-24h或37℃过夜培养。

【注意】：当质粒中含不稳定片段，30℃培养能降低错误重组的概率。当转化pUC19对照，需37℃过夜培养。

【注意】：a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，可将所有转化产物涂布平板。b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于30℃直至液体被吸收后再倒置培养。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

附表1 固体和液体LB培养基配方

附表2 固体和液体SOC培养基配方

附录1. Stable感受态细胞常见问题

1.  Stable菌株的基因型和各基因赋予菌株的特征？

Stable基因型：F' proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC

◇  蓝白斑筛选（Φ80 Δ(lacZ)M15）：使得β-gal omega片段。lacX74去除染色体上的β-gal基因。pUC19和相似基因编码β-半乳糖苷酶（lacZ）的α肽。α肽与β-半乳糖苷酶的omega片段（由F'携带，α-互补）结合。当β-半乳糖苷酶按照这种方式重新组合后能正常表达并切割X-gal生成蓝斑。当克隆DNA进入质粒破坏α肽基因，使得菌落为白斑。

◇  重组缺陷（recA1）：大肠杆菌（E. coli）本身具修复系统能重组同源序列。基因组克隆通常有复制区，recA介导的重新排列不确定，特别当同源序列长于50bp。recA功能缺失的菌株比recA+菌株通常更缓慢生长。

◇  内切酶I缺陷（endA1）：野生型大肠杆菌的周质空间含非特异性内切酶。从这些菌株中制备质粒特别要注意质粒被降解。endA突变去除这个基因，显著改善了质粒制备物的质粒。

◇  限制缺陷（Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：野生型大肠杆菌K12菌株含限制性内切酶，能切割含位点(AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT的DNA。虽然大肠杆菌DNA自身受保护，不被同源甲基转移酶所降解，但外源DNA会在这些位点被切割。限制缺陷删减了甲基转移酶和内切酶的基因。

◇  甲基限制缺陷（mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：大肠杆菌具有一套酶系统，mcrA，mcrB和mrr能够切割在高等真核生物和某些植物、细菌菌株发现的甲基化DNA。来自PCR扩增片段，cDNA或原先在大肠杆菌内扩繁的DNA不会被甲基化，也不会被切割。

◇  T1噬菌体抗性（fhuA）：T1，一种极端烈性噬菌体需要大肠杆菌羟肟酸铁吸收受体用来感染。这个基因的删减赋予对这个噬菌体的抗性，且不会显著影响转化或细胞的生长特征。

2.  Stable感受态细胞能替换Stbl2或Stbl3吗?

答复：是的，Stable建议用于所有难克隆实验。Stable菌株的基因型与Stbl2或Stbl3没有关联性，但性能更优越。通过分别克隆DNA片段（含5 x 32bp 重复序列）到三个菌株来比较性能。

通过NEB Gibson Assembly 技术构建的重组质粒pUC-5xREP，然后将构建的重组质粒反应体系分别转化进入三种感受态细胞，之后用克隆PCR来分析5xREP插入序列稳定性。

~30℃，24h，Stbl2克隆生长到1mm直径，在测定的所有插入质粒的克隆中都发现缺失（33个克隆，33个都有缺失）；

30℃，18-20h，Stbl3克隆生长到1mm直径，在测定的所有插入质粒的克隆中67%有完整的5xREP插入序列（33个克隆，22个正确）；

Stable在30℃生长很好，30℃，18-20h，Stable克隆生长到1mm直径，5xREP插入序列稳定性是做好的。在测定的所有插入质粒的克隆中97%有完整的5xREP插入序列（33个克隆，32个正确）；

更重要的是，Stable含endA突变（与Stbl3不同），提取质粒中无核酸内切酶I污染。

3. Stable感受态细胞适合大质粒转化？

答复：是的，根据NEB官方（Stable菌株开发商）数据，Stable成功转化24kb质粒。与pUC19（2.7kb）比较，当等量DNA分子转化进入细胞，24kb质粒的转化效率约为pUC19的80%。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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