EHA101 Chemically Competent Cell 农杆菌化学感受态细胞

产品标签：

EHA101菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif）利福平；Kanamycin（kan）卡那霉素；EHA105；LBA4404；GV3101；AGL1；植物转基因研究；

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产品描述：

EHA101菌株的染色体背景为C58，核基因含利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101（pTiBo542DT-DNA），此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101（pTiBo542DT-DNA）质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。pEHA101（pTiBo542DT-DNA）质粒携带筛选标签kan，赋予EHA101菌株卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。

我司提供的EHA101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，基因型为C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542D T- DNA) (kanR) Nopaline，经pK7WGF2质粒（壮观霉素抗性）检测转化效率>104cfu/μg DNA。

产品组分：

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，6个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1、感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2、整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3、加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4、为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5、转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6、平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。

7、利福平浓度应≤25μg/ml，过高浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。我司EHA101感受态计算转化效率时所用平板只含50μg/ml卡那霉素，若所用平板含20μg/ml利福平，则转化效率降低到1/2。

8、培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）。

9、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1、取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完全融化。

2、往100μl感受态细胞悬液中加入1μg（体积不大于10μl）目的DNA，用手拨打管底使其混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

3、加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。

4、6,000rpm离心1min，吸掉600ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。

   【注意】：当平板只含转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48h即可；当平板中加入双元载体抗生素的同时，再加入20μg/ml利福平时，需28℃培养60h；若使用的平板含50μg/ml利福平，需在28℃培养72-90h。

附表1 固体和液体LB培养基配方

附表2 固体和液体YEB培养基配方

 — — Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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