Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）检测试剂盒

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Reactive Oxygen Species，ROS活性氧；DCFH-DA；JC-1线粒体模电位探针；JC-10；CAS NO：4091-99-0；

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研究意义：

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

产品描述：

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，或ROS Assay Kit）是一种利用荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）进行细胞内活性氧水平检测的常用方法。检测原理在于DCFH-DA本身无荧光，能自由穿过细胞膜，一旦进入细胞后，被胞内的酯酶水解生成无荧光的DCFH。DCFH不能穿透细胞膜，从而保留在胞内。此时胞内的活性氧可以氧化DCFH生成有荧光的DCF。通过DCF荧光的强弱即可反映活性氧的水平。

本试剂盒包含活性氧阳性对照Rosup，利于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/ml。因检测对象和反应体系的不同，本试剂盒可检测100-500个样品。

产品组成：

保存与运输方法：

保存：-20ºC保存，有效期一年。

运输：冰袋运输。

使用方法

1. 装载探针

【注意】：对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照Rosup和/或待研究药物刺激细胞；对于刺激时间较长（通常6h以上）的细胞，先用活性氧阳性对照Rosup或待研究药物刺激细胞，后装载探针。

1.1 原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）

1）检测前一天进行细胞铺板，确保活性氧检测当天细胞汇合率达到50~70%。

2）吸出细胞培养液，加入适量体积以及浓度的待研究药物，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。

【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3）按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM.。吸出细胞培养液，加入适当体积DCFH-DA工作液。【注意】：加入体积以能充分盖住细胞为宜。对于6孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。对于96孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37ºC细胞培养箱内孵育20min。

5）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针

1）按照常规方法，清洗并收集足量的细胞。【注意】：保证细胞的状态健康。

2）用适量体积以及浓度的待研究药物重新悬浮细胞，于37ºC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。【可选】阳性对照Rosup：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20~30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异【刺激时间可参考文献或实验经验来调整】。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高Rosup的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低Rosup的工作浓度。

3）探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM.。

4）离心，吸出细胞内刺激药物，之后用适量DCFH-DA工作液重悬细胞，使得细胞密度为1×106~2×107/ml。【注意】：细胞密度需根据后续检测体系，检测方法，以及检测总量来调整。例如，对于流式分析，单管检测内细胞数目控制在104~ 106之间。

5）37ºC细胞培养箱内孵育20min。每隔3~5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

6）用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2. 检测

2.1 原位装载法

可用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2.2 收集细胞后装载法

可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可用激光共聚焦显微镜直接观察。

3. 参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可用FITC的参数设置检测DCF。

4. 其他说明

1）对于某些细胞，若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000稀释DCFH-DA，使DCFH-DA的工作浓度为2～5μM。探针装载时间也可依情况在15～60min内适当进行调整。

2）Rosup仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入Rosup阳性对照。

注意事项

1）探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2）探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3）尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 — — Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。

文献引用：

【1】

Wang YW et al. Screening of Duck Tembusu Virus NS3 Interacting Host Proteins and Identification of Its Specific Interplay Domains. Viruses 2019, 11(8), 740;

HEK293 cells were first transfected with pCAGGS and pCAGGS-PRDX1. When PRDX1 was highly expressed for about 24 h, cells were infected with DTMUV and treated for 6 h, whereas the Rosup positive control group was set in parallel. Finally, the probe of DCFH-DA was diluted at 1:1000 and treated at 30 °C for 20 min referring to the ROS Assay Kit (MKBio, Shanghai, China). Cells were then observed under a fluorescent inverted microscope immediately.

【2】

Zhi-Hao Hu, Guo-Jun Wang, Rui-Xin Li, Tian-Yu Zhu, Zhuo-Yin Wang, Heng-Xuan Ding, Xiu-Mei Hu, Upregulation of miR-133a-3p enhances Bufothionine-induced gastric cancer cell death by modulating IGF1R/PI3K/Akt signal pathway mediated ER stress, Life Sciences, 10.1016/j.lfs.2020.118180, (118180), (2020).

The DCFH-DA ROS assay kit (MKBio, Shanghai, China) was used to measure the ROS levels of the GC cells. In brief, GC cells were prepared and incubated with 5 μM DCFH-DA staining solution in the dark for 30 min at 37 °C.

The DCFH-DA ROS assay kit (MKBio, Shanghai, China) was used to measure the ROS levels of the GC cells. In brief, GC cells were prepared and incubated with 5 μM DCFH-DA staining solution in the dark for 30 min at 37 °C.

[3]

Liu, Y.; Xiao, S.; Sun, H.; Pei, L.; Liu, Y.; Peng, L.; Gao, X.; Liu, Y.; Wang, J. AtPPRT1, an E3 Ubiquitin Ligase, Enhances the Thermotolerance in Arabidopsis. Plants 2020, 9, 1074.

The ROS production in the seedlings was detected by using fluorescent dye 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) (Maokang, Shanghai, China), as described previously [32]. The 7-day-old different-genotype seedlings grown on MS solid medium were exposed to 45 °C for 3 h, and the seedlings were collected and stained at 22 °C for 15 min in 50-μM H2DCFDA (dissolved in MES-KCl buffer, MES 10 mM, KCl 50 mM, adjust to pH 5.5 with HCl). The seedlings washed with distilled water were placed under a Leica confocal microscope. The fluorescence in cotyledons and roots of seedlings were detected by using an excitation wavelength of 488 nm

[4]

Shen LD, Qi WH, Bai JJ, Zuo CY, Bai DL, Gao WD, Zong XL, Hao TT, Ma Y, Cao GC. Resibufogenin inhibited colorectal cancer cell growth and tumorigenesis through triggering ferroptosis and ROS production mediated by GPX4 inactivation. Anat Rec (Hoboken). 2021 Feb;304(2):313-322. doi: 10.1002/ar.24378. Epub 2020 Feb 7. PMID: 31961485.

The intracellular ROS levels in CRC cells were measured by using the
2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH- DA) ROS assay kit purchased from MKBio
(Shanghai, China) according to the manufacturer's instruction 

[5]

Yan, W., Zhang, Y., Hu, L. et al. Febuxostat Inhibits MPP+-Induced Inflammatory Response Through Inhibiting the JNK/NF-κB Pathway in Astrocytes. Neurotox Res 39, 566–574 (2021). https://doi.org/10.1007/s12640-020-00316-8

The astrocytes were planted on 24-well cell culture plates at a density of 1 × 10 5 cells/well for 24 h. After necessary stimulation, cells were loaded with 5 μM DCFH-DA (MX4802, MKBio, China) and incubated for 30 min in darkness.