Luc 报告基因底物/ D-Luciferin D-萤火虫荧光素钾盐

活体成像研究/体外生物发光研究/转录水平研究

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搜索关键词：

Luc reporter gene 报告基因；In vivo imaging 活体成像研究；转录水平研究；荧光素酶/ATP水平研究；报告基因质粒；报告基因病毒颗粒；萤火虫荧光素；甲虫荧光素；CAS：115144-35-9；

基本描述：

D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整个生物技术领域，特别是体内活体成像技术。作用机制是在ATP和荧光素酶的作用下，D-荧光素（底物）被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。将携带荧光素酶编码基因（Luc）的质粒转染进入细胞后，导入研究动物如大小鼠体内，之后注入荧光素，通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。也可以利用ATP对此反应体系的影响，根据生物发光强度的变化来指示能量或生命体征。

基本应用：

D-荧光素也常用于体外研究，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。

常见商业化类型的差异（荧光素钾，钠，游离酸）：

目前市场上有三种产品形式，D-荧光素（游离酸），D-荧光素（钠盐），和D-荧光素（钾盐）。这三种产品主要差别在于溶解特性。

1）D-荧光素（游离酸）在水以及缓冲体系内的溶解性都很弱，除非溶于弱碱如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-荧光素（钠盐）和D-荧光素（钾盐）能够非常容易且快速的溶入水或者缓冲液中，使用方便，溶剂无毒性，特别适合体内实验。配成溶液后的三种产品，在绝大多数应用上都没有实质性的差别。

3）D-荧光素（钠盐）和D-荧光素（钾盐）基本上没有差别，主要是使用习惯等因素影响。整体来看，钾盐的应用文献明显多于钠盐。

D-荧光素钾盐基本特性：

1）CAS NO：115144-35-9

2）化学名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3）分子式：C11H7N2O3S2K

4）分子量：318.42 g/mol

5）纯度：＞99% (HPLC)，分子生物学级（超纯）

6）外观：浅黄色至黄色粉末

7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）

使用方法：

A．体外生物发光检测

1）储存液制备

用蒸馏水溶解D-荧光素（钾盐），配制成15mg/ml的储存液（100×），混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。建议使用的工作液浓度为150µg/ml（相当于468µM）。

2）荧光素酶反应缓冲液制备

配方【1×，参考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具体缓冲液组成可参考其他文献资料来调整。按照以上配方制备荧光素酶反应缓冲液（2×）。

3）收集细胞裂解上清（荧光素酶表达）

根据需要检测的细胞类型，选择合适的裂解液进行细胞裂解，离心收集上清后续检测待用。

4）萤火虫荧光信号检测

【注①】：萤火虫荧光信号的检测方法大体上取决于冷光测定仪（luminometer）类型（是手动型荧光计、单管注射型或者酶标板读数型荧光计）。根据特定发光测定仪，来考虑注射用量和程序设置。

【注②】：需设置不含荧光素酶的孔（用作阴性对照），以测定背景荧光。

例：注射式冷光测定仪（injectible luminometer，单样或微孔板，200µl终体积）

a）吸取100µl荧光素酶反应缓冲液（2×）到一干净的冷光测定仪比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98µl裂解上清到皿或孔内；

c） 如果有需要，用水来补足使得总体积到198µl；

d）设置程序注射2µl荧光素储存液（使工作浓度150µg/ml），程序：2~5秒延迟（delay），之后10s测定。

B．活体成像分析

1）用无菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-荧光素（钾盐）工作液（15mg/ml），0.2µm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。

2）注射量取决于注射方式，具体如下：

3）注射入体内10-20 min（待光信号达到最强稳定平台期），再进行成像分析。

注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。

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注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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引用文献：

[1]Ulinastatin Inhibits Nasopharyngeal Carcinoma Metastasis by Suppressing uPA/uPAR Signaling

At the termination of the experiment, the mice were injected with 150 mg/kg of D-Luciferin Potassium Salt (Mkbio, MX4603-100MG) before isoflurane anesthesia.

[2] Li, X., Wang, Z., Jiao, C. et al. Hepatocyte SGK1 activated by hepatic ischemia-reperfusion promotes the recurrence of liver metastasis via IL-6/STAT3. J Transl Med 21, 121 (2023).https://doi.org/10.1186/s12967-023-03977-z

Bioluminescent imaging

Bioluminescent imaging was used to monitor tumor burden at 7 days in a nonlethal manner. Prior to imaging, mice were anesthetized using Isofluorane followed by i.p. injection of D-Luciferin, Potassium Salt (Maokang Biotech, Shanghai, China) at a concentration of 150 mg/kg in 0.1 ml PBS 10 min. The mice were then placed in the chamber for an IVIS Spectrum imaging system (PerkinElmer, USA) from Nanjing Medical University.

[3]Liu Y, Chen S, Wan X, Wang R, Luo H, Chang C, Dai P, Gan Y, Guo Y, Hou Y, Sun Y, Teng Y, Cui X, Liu M. Tryptophan 2,3-dioxygenase-positive matrix fibroblasts fuel breast cancer lung metastasis via kynurenine-mediated ferroptosis resistance of metastatic cells and T cell dysfunction. Cancer Commun (Lond). 2024 Nov;44(11):1261-1286. doi: 10.1002/cac2.12608. Epub 2024 Sep 2. PMID: 39221971; PMCID: PMC11570772.

Mice were anaesthetized and intraperitoneally injected with D-luciferin (150 mg/kg, MX4603-100MG, Maokangbio, Shanghai, China) to monitor metastasis by bioluminescence imaging (BLI) with the in vivo imaging system (IVIS) (Caliper Life Sciences, Hopkinton, Massachusetts, USA).