| 目录号 | MF2484-5000UL | 售价 | 1990元 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 规格 | 50×100μl | 运输温度 | 干冰运输 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 其他名称 | 保存温度 | -80℃保存 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CAS号 | N/A | 有效期 | 6个月 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 应用 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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产品简介: Rosetta 2(DE3)pLysS Chemically Competent Cell 大肠杆菌化学感受态细胞
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菌株描述 Rosetta 2宿主菌是BL21衍生菌，特别设计用于提高含大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达水平，这些菌株补充7种大肠杆菌缺乏的稀有密码子（AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC, CGG）对应的tRNA，位于兼容的氯霉素抗性质粒上。tRNA基因由天然启动子所启动。
DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因）。这种菌株适用于目的基因克隆在pET载体上的蛋白生产，由IPTG诱导表达。
pLysS菌株能表达少量T7溶菌酶（一种天然的T7 RNA聚合酶抑制剂）。T7溶菌酶能作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，降低目的基因的背景表达水平，但不会干扰IPTG诱导的表达，从而能够稳定重组表达的蛋白，特别是毒性蛋白。
Rosetta 2(DE3)pLysS基因型：F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (CamR)
产品描述 本品是大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率＞107 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。
产品包装
保存与运输条件： 保存：-80℃保存，六个月有效。 运输：干冰运输。
注意事项 1） 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存，不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。 2） 最好在冰上融化感受态细胞，不可在冰上放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。 3） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。 4） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。 5） 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。 7） 诱导时，IPTG浓度范围可选：0.1~2mM。 8） 为了得到足量的蛋白，需就最佳诱导时间、温度、IPTG浓度进行优化。 9） Rosetta 2(DE3)pLysS菌株携带pLysSRARE2质粒，除复苏培养基无抗生素外，其余培养基（液）都应含氯霉素（34μg/ml），以防质粒丢失 10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
1） 将感受态细胞从-80℃取出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化后，加入目的DNA，用手轻弹管底轻轻混匀（避免用移液枪吹打），冰浴静置25min。 2） 42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。 3） 向每个离心管中加入700 μl无菌的LB或2YT培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 4） 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取50μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，加到含34μg/ml氯霉素以及转化质粒筛选用抗生素的LB或2YT固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃过夜培养。
【注意】： a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，可取200-300 μl转化产物涂布平板。若预计的克隆较少，可通过离心（5,000 rpm，1min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。
b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。
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附录I 蛋白诱导步骤（仅作参考） 1）从新鲜涂布平板上挑取一单克隆，转移到含相应抗生素的5ml LB液体培养基内。 2）37℃摇菌培养过液。为了最小化诱导前目的蛋白的最小化表达，添加葡萄糖（终浓度为0.2% w/v）到生长培养基内。 3）将步骤2）中过夜培养的菌液吸取0.5ml接种到含相应抗生素的50ml LB液体培养基内。 4）37℃摇菌培养直至OD600达到0.6~0.8。 5）加入IPTG使其终浓度为1mM。目的蛋白的最佳诱导时间可能在2~16h，依蛋白而异。 6）37℃培养3~4h。为了确定目的蛋白的最佳诱导时间，建议作一个时间周期优化实验，范围从2~16h。 7）将培养物冰浴10min。4℃，5,000 x g离心10min收集菌株。 8）吸掉上清，将沉淀保存在-20℃（也能保存在更低的温度）。 IPTG母液（1M）配制 称量2.38g IPTG（Mw: 238.30）溶于适量去离子水，充分溶解后，调整终体积到10ml，并过滤除菌，即得到1M ITPG母液。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
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