Fluo-5N AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针

重要提醒（购买或初次使用前）请务必查阅：

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（MS4301-1G）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

搜索关键词：

Fluo-5N AM；Fluo-5F AM；Fluo-4, AM；可见光激发波长Ca2+荧光探针；Fluo-4；

产品信息：

基本介绍：

Fluo-5N是Fluo-4的结构类似物，具更低的钙结合亲和力，使其非常适用于钙水平在1µM~1mM区间内的胞内钙离子检测，而Fluo-3和Fluo-4在这个区间内的钙离子反应达到饱和。Fluo-5N与氩离子激光器的488nm激发光兼容，使其适用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等仪器。激发和发射波长分别是494和516nm。一旦与钙离子结合，荧光强度增加大于100倍，波长迁移非常少。

Fluo-5NAM是Fluo-5N的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。

产品特性

1）同义名：Fluo-5N, Acetoxymethyl Ester;

2）分子式：C50H47F2N3O25

3）分子量：1127.92

4）Ex/Em：494/516nm（Ca2+-bound）

5）解离常数：~90µM

6）纯度：≥95% (HPLC)

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

8）化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）  荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）  乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

3）  Fluo-5NAM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

4）  Fluo-5NAM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

5）  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

A，  试剂准备

1）  配制Pluronic F-127母液：称取100mgPluronic F-127粉末（货号：MS4301-1G）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2)或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1）  用无水DMSO溶解Fluo-5NAM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Fluo-5NAM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Fluo-5NAM中加入11µl无水DMSO）。准备Fluo-5NAM工作液之前，有时需要往Fluo-5NAM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Fluo-5N AM染色工作液制备前，添加一定体积的20% Pluronic F-127溶液到Fluo-5NAM+ DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】：

2）  用HHBS或其他生理缓冲液（含钙镁）将Fluo-5NAM+DMSO储存液稀释到1-20µM的工作液。

【注①】：Fluo-5N AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：

3）  【可选】如果细胞内（比如CHO细胞）含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

4）  将准备好的Fluo-5NAM染色工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。室温或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Fluo-5NAM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

【注②】：

【注③】：

5）  吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如1mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6）  室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7）  用合适的激发/发射波长来检测荧光（见附录I：Fluo-5N的激发和发射光谱）

相关产品

附录I Fluo-5N的激发和发射光谱

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。

应用文献：

[1] Lin S, Yin S, Shi J, Yang G, Wen X, Zhang W, Zhou M, Jiang [1]X. Orchestration of energy metabolism and osteogenesis by Mg²⁺ facilitates low-dose BMP-2-driven regeneration. Bioact Mater. 2022 Mar 24;18:116-127. doi: 10.1016/j.bioactmat.2022.03.024. PMID: 35387176; PMCID: PMC8961427.

Measurement of Mg²⁺ entry and mitochondrial Mg²⁺ intake was conducted through confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica, Germany). BMSCs were incubated with the Mg²⁺ probe Mag-Fluo-4 AM (2.5 × 10⁻⁶ mol L⁻¹, green fluorescence, MKBio, China) and the mitochondrial indicator MitoTracker Red CMXRos (0.5 × 10⁻⁶ mol L⁻¹) in growth medium at 37 °C for 30 min. 

[2] Che S, Chen S, Li S, Ruan Z. Decabromodiphenyl ether initiates mitochondria-dependent apoptosis by disrupting calcium homeostasis in mice livers. Chemosphere. 2022 Mar;291(Pt 1):132767. doi: 10.1016/j.chemosphere.2021.132767. Epub 2021 Nov 5. PMID: 34748805.

Mag-Fluo-AM and Rhod-2AM (Maokang Biotech, Shanghai, China) probes.  Mag-Fluo-AM monitors ER Ca²⁺ concentration, and Rhod-2AM indicated mitochondrial Ca²⁺ level. Cellular images were acquired by using the Operetta CLSTM High Content Analysis System (PerkinElmer, Massachusetts, USA) or an inverted fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti-SR, Tokyo, Japan).

[3] Shuyao Zhu et al. Investigation of the impact of widely used pesticides on conjugative transfer of multidrug resistance plasmids. Journal of Hazardous Materials. Volume 478, 5 October 2024, 135436

 A probe Mag-Fluo-4 (Maokangbio, China) with a final concentration of 10μM was used to detect the intracellular Mg 2+ content with excitation and emission wavelengths 

[4] Huang L, Ma L, Zhao Q, Zhu Q, She G, Mu L, Shi W. Simultaneous Imaging of pH and Peroxynitrite in the Endoplasmic Reticulum and Mitochondria: Revealing Organelle Interactions in Alzheimer's Disease Pathogenesis. Anal Chem. 2025 Jan 14;97(1):194-202. doi: 10.1021/acs.analchem.4c03646. Epub 2024 Dec 26. PMID: 39723923.

Mag-Fluo-4 AM was purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd (China).

[5]  Li G, Sun C, Zhu L, Zeng Y, Li J, Mei Y. High cadmium exposure impairs adult hippocampal neurogenesis via disruption of store-operated calcium entry. Ecotoxicol Environ Saf. 2024 Nov 1;286:117162. doi: 10.1016/j.ecoenv.2024.117162. Epub 2024 Oct 9. PMID: 39383818.

2.11. Ca²⁺ imaging

SH-SY5Y cells were seeded at 1 × 10⁴ cells per well in 6-well plates embedded with a coverslip at the bottom. Cells were treated with 10 μM CdCl₂ and/or 5 μM HYP for 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, or 12 h, and then incubated with HBSS medium containing cytoplasmic Ca²⁺ probe (Fluo-3 AM, S1056, Beyotime) or ER Ca²⁺ probe (Fluo-5N AM, MX4562, MKbio) for 25 min at 37°C. Subsequently, the cells were staining with DAPI solution. The fluorescence intensity of Ca²⁺ signals and images were collected and analyzed by confocal microscopy (FV 1000, Olympus). To detect cytoplasmic and ER transient Ca²⁺ signals in the SH-SY5Y neuroblastoma after Cd exposure, the relative fluorescence intensity of Ca²⁺ signals were collected and analyzed by two-photon microscopy (FVMPE-RS, Olympus).

[6]Li H, Liu J, Liu Y, Liu Y, Lu K, Wen J, Zhu H, Liang D, Li Z, Wu L. Two novel variants in CNNM2 disrupts magnesium efflux leading to neurodevelopmental disorders. Front Genet. 2025 Jun 19;16:1600877. doi: 10.3389/fgene.2025.1600877. PMID: 40612795; PMCID: PMC12222124.

48 h after transfection, intracellular magnesium levels in HEK293T cells were assessed using Mag-Fluo-4 a.m. (Cat# MX4544, Maokang Biotech, Shanghai, China) as directed by the manufacturer. The cells in each group were incubated at 37°C for 10 min with Hanks’ Balanced Salt Solution containing Mg²⁺ (Cat# C0219, Beyotime, Jiangsu, China). Then, 4 μL of 2.5 mM Mag-Fluo-4 a.m. stock solution and 5 μL of 20% Pluronic^® F-127 (Cat# MS4302, Maokang Biotech, Shanghai, China)