PKmito DEEP RED (PKMDR)  活细胞线粒体荧光探针

产品信息

产品描述

PKmito DEEP RED (PKMDR)是北京大学陈知行课题组研发的PKmitoTM系列染料中的成员之一，兼具明亮的荧光、非常低的化学毒性和光学毒性，以及优秀的线粒体定位能力的特征[1]。

PKmito DEEP RED (PKMDR)高特异性标记活细胞的线粒体。由于胞内分子三线态淬灭剂COT基团的存在，赋予该探针极其低的光学毒性，从而使其适合用于线粒体的长时间示踪。PKMDR-FLIM是一种非常有效的工具以高时空分辨率直接成像观察线粒体膜电位（Δψm）[2]。PKMDR的最大吸收和发射波长分别是：644nm和670m，能用标准的Cy5滤片成像，也能用于宽场、共聚焦、SIM或FLIM显微镜。

PKmito DEEP RED (PKMDR)的重要特征：

j Ab：644nm；Em：670m；

k 适用于活细胞线粒体的长期成像；

l 不适合用于固定细胞的线粒体染色；

m 兼容于宽场、共聚焦、SIM或FLIM显微镜。

产品特性

保存与运输方法

保存：≤-20°C避光干燥保存，收到货至少12个月有效。 

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 本品量非常少，使用前低速离心后直接加适当溶剂溶解使用，切勿分装称量。

2） 整个染色过程中需注意避光。

3） PKmito DEEP RED (PKMDR)虽有报道用于STED超分辨显微技术，但成功率比较低。若需深红色激发通道的线粒体荧光探针，且需做STED，推荐使用HBmito Crimson（MX4329-5nmol）。

4） PKmitoTM产品的商标持有者是Genvivo Biotech Co., Ltd.

5） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 储存液的配制

j 初次使用，请将低温保存的PKMDR（固体）置于室温回温至少20min，低速离心3~5min。

k 于超净台内开盖，直接往管内加入适量高质量的无水DMSO使其溶解，配制成250µM（1000×）母液。本染料可以反复冻融，因此，不建议分装。每次使用完毕后，请将1000×母液置于≤-20°C 以下避光冻存。但务必要注意，每次开盖取样前，不管是固体还是母液，都必须让其恢复到室温。在正确的溶解和储存和使用习惯下，母液至少能稳定保存3个月。

a）MX4328-5nmol：往管内加入20µl无水DMSO，使其溶解且充分混匀，得到250µM（1000×）母液；

b）MX4328-25nmol：往管内加入100µl无水DMSO，使其溶解且充分混匀，得到250µM（1000×）母液；

l 如需长期保存，可在产品初次开封后，用DMF或任意比例的乙腈水溶液溶解产品后分装，真空干燥、冻干或氮气吹干后，即可长期保存（至少一年）。

2. 染色工作液的配制

于实验前，用37℃预热的常用细胞培养基（比如：DMEM+10% FBS）将适量的250µM母液稀释到250nM（1×）工作液，简单涡旋或用枪吹匀后备用。染色工作液必须新鲜配制，久置后可能导致部分染料降解或沉淀。染色工作液不可重复使用。

3. 细胞准备和染色

j 按常规方法，在爬片上、玻底培养皿或玻底多孔板中接种和培养细胞。

k 当细胞生长到所需密度，用新鲜配制的染色工作液替换旧的培养基，确保染色工作液覆盖所有的细胞。l 于37℃、5% CO2的培养箱中避光孵育15~30min。

m 用37℃预热的培养基清洗细胞1~2次，之后更换成不含探针的培养基，即可用于荧光成像。

4. 细胞成像

PKMDR染色后的细胞最好用标准的Cy5滤片设置来进行成像。

染色示例（来自文献，仅做参考）

文献来源1)：Saimi, Dilizhatai, et al. "Imaging mitochondrial membrane potential via concentration-dependent fluorescence lifetime changes." Nature Communications 16.1 (2025): 11088.

实验目的：活细胞FLIM成像的PKMDR标记

实验方法：成像前一天接种细胞在玻底培养皿，密度约4× 104 个细胞/ml。细胞用含250nM PKMDR的DMEM培养基于37℃孵育20min。之后用预热PBS清洗3次以去除未结合染料，然后加入不含染料的DMEM进行成像分析。如有必要，成像前再孵育15min能减少非特异性的ER标记。

Fig 1. a Time-lapse FLIM imaging of PKMDR-stained mitochondria in L929 cells. Images were acquired every 15 s. Spontaneous mitochondrial membrane potential change events were indicated with arrows. b Fluorescence lifetime profiles of the two ROI specified in (a). c Time-lapse FLIM imaging of mitochondria in a neuron. Images were acquired every 11 s. Two mitochondria underwent transportation are indicated with arrows. Scale bars, 20 μm.

文献来源2)：Vringer, E., Heilig, R., Riley, J.S. et al. Mitochondrial outer membrane integrity regulates a ubiquitin-dependent and NF-κB-mediated inflammatory response. EMBO J 43, 2 (2024). https://doi.org/10.1038/s44318-024-00044-1

实验目的：活细胞成像和时差显微镜（TLM）检测

实验方法：细胞接种在μ-Slide载玻片培养腔室或35mm培养皿。细胞用DMSO或S6/ABT-737/Q-VD-Oph处理。MitoTracker Green (200 nM), PkMito DeepRed (1:2000)和Hoechst (1:2000)分别于成像前1h，30min和15min加入，并做清洗。

Fig 2.(A) Timelapse of U2OS cells expressing GFP-NEMO. Cells were treated with 10 μΜ ABT-737, 10 μΜ S63845 and 30 μΜ Q-VD-OPh. Mitochondria and nuclei are visualised using PkMito DeepRed and Hoechst, respectively. Cells were treated for 1 h with images taken every 10 min. Image is representative for three independent experiments. Scale bar is 20 μm.

参考文献

[1]Yang, Zhongtian, et al. "Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging." Chemical science 11.32 (2020): 8506-8516.

[2]Saimi, Dilizhatai, et al. "Imaging mitochondrial membrane potential via concentration-dependent fluorescence lifetime changes." Nature Communications 16.1 (2025): 11088.

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