SM10 λpir Chemically Competent Cell

大肠杆菌化学感受态细胞

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菌株描述

SM10 λpir是从SM10菌株改造而来，SM10是S17-1菌株的衍生菌，后者是构建用于高效接合转移的经典菌株。SM10 λpir菌株适用于作为携带R6K复制起始位点（ori）的穿梭质粒或自杀性质粒的接合转移供体菌株（donor strain），常用于基因敲除、细菌遗传学操作和转座子诱变。

SM10 λpir菌株的主要特征：

j 接合转移功能：含整合在染色体上的RP4接合转移系统基因（RP4-2-Tc::Mu），使其能高效的将携带oriT（转移起始位点）的质粒通过接合作用转移到受体菌（recipient strain），比如：沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、耶尔森菌、霍乱弧菌等其他革兰氏阴性菌。

k λpir溶原菌：表达pir蛋白（pir基因产物），pir蛋白是R6K质粒复制起始位点 (oriR6或oriV)的特异性复制起始蛋白，只有表达pir蛋白的宿主细胞才能复制带oriR6K复制起点的质粒。

l recA1：缺失同源重组能力，维持质粒在供体菌中的稳定性。

m 链霉素敏感:便于接合后利用链霉素进行受体菌的反向筛选（SM10本身对链霉素敏感，然而许多受体菌具链霉素抗性）。

n 选择性标记（抗性标记）: 染色体上含卡那霉素抗性基因（Kmᵣ）

SM10 λpir菌株基因型：thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu (Kmᵣ) λpir

产品描述

本品是大肠杆菌SM10 λpir菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率可达1×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存。

2） 最好在冰上融化感受态细胞，不可在冰上放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

3） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到最低。

5） 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6） SM10 λpir菌株具卡那抗性，不能用于携带卡那抗性质粒的转化。

7） 后续进行阳性菌落的扩繁和高纯质粒的获取，推荐选用TB培养基（Terrific Broth），优于LB或SOC。

8） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1） 从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物），用手轻弹管底轻轻混匀（避免用枪吸打），冰浴静置25min。

2） 42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

3） 向每个离心管中加700 μl无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4） 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含所选质粒筛选抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养过夜（12-15h）。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（5000 rpm，1min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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附录S17-1 λpir(pSC189) and SM10 λpir(pSC189)供体菌的构建

【来自文献：Ferrières L, Hémery G, Nham T, Guérout AM, Mazel D, Beloin C, Ghigo JM. Silent mischief: bacteriophage Mu insertions contaminate products of Escherichia coli random mutagenesis performed using suicidal transposon delivery plasmids mobilized by broad-host-range RP4 conjugative machinery. J Bacteriol. 2010 Dec;192(24):6418-27. doi: 10.1128/JB.00621-10. Epub 2010 Oct 8. PMID: 20935093; PMCID: PMC3008518.】

Fig. History of construction of S17-1 λpir(pSC189) and SM10 λpir(pSC189) donor strains for transposon-based random mutagenesis using the R6K suicide plasmid pSC189. The RP4-2-Tc::Mu plasmid carries loci coding for RP4 conjugation machinery (Tra1, Tra2, and Tra3), a tetracycline resistance marker interrupted by Mu (Tc::Mu), and genetic elements coding for kanamycin resistance (Kmr). RP4-2-Tc::Mu integration into the chromosome of E. coli was isolated after cotransformation with the incompatible mini-RP4 plasmid pSR120 and selection for clones displaying both kanamycin and tetracycline resistance (step 1). The clones obtained were cured from pSR120, leading to SM10 (parental strain, S49-20 Kmr) or S17-1 (parental strain, E. coli 294 Smr Tpr, following inactivation of the RP4-associated kanamycin resistance gene by Tn7 insertion), which contain the integrated RP4-2-Tc::Mu plasmid (ChRP4), as described previously (step 2) (40). For simplicity, only a single depiction is presented for strains SM10 and S17-1. Finally, the Π-encoding gene pir was introduced at the λ site (step 3), and the strains were transformed with the suicide vector pSC189, which carries a mariner-based transposon (Tn) and its C9 transposase (transposase) and harbors the RP4-dependent origin of conjugation, oriT, for mobilization and the Π-dependent origin of replication, oriR6K (step 4) (11, 14, 28).

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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