PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）

产品关键词：

PKH67；PKH26；Calcein AM钙黄绿素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking体内细胞示踪；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

产品信息

【好消息】：应客户的要求，我司对试剂盒内的Diluent C可单独供应，产品信息如下：

产品描述

PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于荧光探针PKH67，用于常规细胞膜标记的检测试剂盒，适用于体外细胞标记，体外细胞增殖以及长期的体内细胞跟踪研究等。

PKH67是一种专利的膜标记探针，与PKH1和PKH2相比，结构上带有更长的脂肪族碳尾，能稳定插入细胞膜脂质区域。正因具更长碳尾，内部数据连续性证明：PKH67具有比PKH2更低的细胞-细胞间转运发生。PKH67呈绿色荧光（见图1），最大激发波长为490nm，最大发射波长是502nm，与标准荧光素（Fluorescein）滤片兼容。PKH67非常适合用于细胞毒性实验，与碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放线菌素D（7-AAD，MX4215）这些细胞活力探针联合使用，或者与橙-红色荧光探针比如藻红蛋白（PE，MX4698）、红色荧光蛋白（RFP）等结合使用。根据染料稀释原理，PKH67常用于细胞增殖监测分析，包括抗原特异性的前体频率和带干细胞特性的静息/缓慢分化肿瘤细胞的鉴定。也能用于监测外泌体或脂质体吞噬，细胞-细胞膜转运、吞噬、抗原递呈，以及体内细胞运输研究。

以不分裂细胞为研究对象，通过对体外细胞膜滞留周期和体内荧光强度减弱频率的关联性分析，预测PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。这与PKH1和PKH2的体内半衰期相近，这两个探针都成功用于监测周期长达1-2个月的体内淋巴细胞和巨噬细胞运输研究，因此，PKH67适用于需要绿色荧光细胞连接染料的短-中期体内示踪研究，以及体外细胞毒性、吞噬、增殖、抗原递呈，或其它共培养实验。

稀释液C（Diluent C）是本试剂盒配套提供的一种水溶性溶液，特别设计的一种标记媒介能维持细胞活力，同时最大化染料溶解性和标记过程中的染色效率。Diluent C对哺乳动物细胞来说是等渗的，不含去污剂或有机溶剂，也不含生理盐和缓冲剂。根据细胞类型，染料标记后膜的内在化程度，标记细胞可能呈现不同的状态，从明亮，到均匀点状或斑驳状。然而，PKH67荧光在生理范围内不依赖于pH，且每个细胞的荧光强度通常不受染料位置的影响。

图1. PKH67的激发和发射光谱图

我司（懋康生物）提供三种规格的PKH67细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建议用于小量或初步研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测25次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于5次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）适用于中量研究，比如体外细胞增殖或毒性研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测50次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）适用于大量或体内研究。当使用2ml染色体积（含2μM终浓度的PKH67），本试剂盒含有足量的染料用于检测125次细胞样本（2×107个细胞/次），和足量的Diluent C用于30次细胞样本（2×107个细胞/次）。用户需根据细胞类型和实验目的来优化确定最佳的染料浓度。

产品包装

保存与运输方法

保存：2-8ºC避光保存，1年有效。其中组分A（PKH67 Dye）需严格避光，盖子保持拧紧。

运输：冰袋运输。

注意事项

1. PKH67是以溶于乙醇的储存液形式提供，保存的过程中需避光并拧紧盖子，以防止溶液挥发引起的染料浓度提高。使用前需检查是否有结晶，若有结晶，需在37℃水浴溶晶，超声或涡旋直至完全溶解。

2. Diluent C使用前需置于室温回温之后再配制标记用的细胞和染料工作液。Diluent C是无菌溶液，不含任何防腐剂或抗生素，使用和保存过程中都注意无菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C内，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，现配现用。

4. 荧光染料均存在淬灭问题，操作和储存过程中需注意避光，以减缓荧光淬灭。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1. 自行准备仪器和试剂（试剂盒不提供，用于常规细胞膜标记）

﹒良好分散，均匀的单细胞悬液（悬浮于组织培养基）

﹒含血清的组织培养基（完全培养基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培养基，或生理盐溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系统兼容的蛋白

﹒聚丙烯锥底离心管（4-15ml）

﹒能控温的离心机（高达1000×g）

﹒荧光分析用仪器（荧光酶标板，荧光或共聚焦显微镜，流式细胞仪）

﹒无菌层流净化罩

﹒血球计数板或自动细胞计数装置

﹒载玻片和盖玻片

2. 常规细胞膜标记

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最终染色体积，含2μM PKH67，以及1×107个细胞/ml。

以下所有步骤都在室温下进行（20-25℃）。

1. 取一锥底聚丙烯离心管制备2×107个细胞的单细胞悬浮液，用无血清培养基清洗细胞一次。

2. 400×g离心细胞5min，得到松散的细胞沉淀。

3. 细胞离心后，轻轻吸掉上清。注意不要移动任何细胞并且残留不超过25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到细胞沉淀中制备成2×细胞悬液，用枪轻轻吹匀以确保完全分散。不可涡旋和不可让细胞长期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制备2×染色液（4μM in Diluent C）：通过将4μl PKH67乙醇储存液到1ml Diluent C中，充分混匀分散所得。

6. 快速加1ml2×细胞悬液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用枪立即混匀样本。混匀后样本得到的终浓度是1×107个细胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的细胞/染料悬液孵育1-5min，中间定期混合。染色过程非常快，更长时间无任何益处。

8. 加入等体积（2ml）血清或其他适当蛋白溶液（比如1% BSA）终止染色，孵育1min允许结合多余的探针。

9. 20-25℃，400×g离心细胞10min，轻轻吸掉上清，确保不会移动细胞。用10ml完全培养基重悬细胞，转移到一个干净无菌的锥底聚丙烯离心管中，20-25℃，400×g离心细胞5min。然后用10ml完全培养基清洗细胞沉淀＞2次，以确保完全去除未结合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完全培养基重悬细胞沉淀，用来评估细胞回收，细胞活力和染色强度。离心和重悬沉淀到一理想终浓度的活细胞悬液。

染色示例（来自文献资源）

1）文献来源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：为了评估旁观者凋亡效应，靶向THP-1单核细胞用PKH67来标记，最终在荧光显微镜观察以确认标记是否成功。标记好的THP-1细胞（未感染的旁观者细胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬细胞（感染效应细胞量：0.5 × 105cells/ml），接种到2孔的LabTek腔室玻片。效应巨噬细胞经H37Ra感染4h，之后剧烈清洗去除胞外细菌。之后与未感染的PKH67标记旁观者细胞共培养，37℃共培养24或48h。孵育后，上清液去除，细胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR监测凋亡，细胞核用Hochest 33342复染。用荧光显微镜来评估绿色PKH67标记巨噬细胞的旁观凋亡效应。当某一个单细胞同时呈绿色（旁观者）和红色（凋亡），表明旁观者凋亡效应的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文献来源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和细胞因子刺激30min，之后，将1 × 106PKH67标记好的凋亡自体中性粒细胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，红细胞用裂解液裂解掉，流式细胞术观察中性粒细胞内凋亡细胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50 μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30 min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60 min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

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延伸阅读（懋康生物独家整理）

鉴于近期大量的用户咨询PKH26用于外泌体染色（exosome stain）的方法，我司查阅相关文献资料，提供染色相关的一些信息，仅供交流学习用。

摘自文献1）Pužar Dominkuš P et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2018 Jun;1860(6):1350-1361. PMID: 29551275

◇◇ 外泌体染色（Exosome staining）(简单流程见Fig 1)

外泌体冻干标准用超纯水重悬制备成1.0μg/μL溶液，之后用PKH26红色荧光检测试剂盒来标记。染色前，溶于Diluent C的PKH26在超纯水水浴锅于37℃孵育15min。对于对照样品，用不含颗粒的DPBS来替代外泌体标准。

① 染色流程A

PKH26用100μL diluent C稀释使其终浓度为8μM（染料浓度）。之后10μg外泌体（in 20μL DPBS，MKBio）用80μL diluent C稀释，加入染料溶液内，孵育5min，同时用枪轻轻混匀。用100μL不含外泌体的10% FBS (in DMEM，MKBio)来结合多余的染料。之后，外泌体用1ml DPBS稀释，4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

② 染色流程B

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到2ml DPBS，转移到Vivaspin20 300-kDa MWCO filters，于4°C（4000×g）离心3min，之后用2ml DPBS清洗3次，最终用沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

③ 染色流程C

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到10ml DPBS，置于2ml 20%蔗糖（in DPBS，，MKBio）的上层。外泌体用4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

④ 染色流程D

外泌体的染色方法同流程A。之后稀释到400μL DPBS，置于20%~60%非连续蔗糖梯度（in DPBS）的上层。外泌体用4°C超速（100000×g，MKBio）离心18h。分层3-6（密度范围1.08–1.15g/mL）吸在一起，分层7-10（密度范围1.17–1.23g/mL）吸在一起，每一份都稀释到30ml DPBS。外泌体用4°C超速（100000×g）离心1h 10min。之后沉淀用50μL DPBS轻轻重悬。

Fig. 1. Schematic representation of staining procedures used to label exosomes with PKH26 dye. Exosomes (exo) were labeled using staining procedures based on ultracentrifugation (procedure A), filtration through Vivaspin concentrators (procedure B), and sucrose cushion (procedure C) and sucrose gradient (procedure D) purification. Key differences between the procedures are highlighted by the green text.

◇◇ 外泌体检测（Confocal microscopy）

取小体积（6μL）轻轻混匀的PKH26标记对照和外泌体样本分别转移到包被有10%多聚L-赖氨酸的盖玻片上，然后封固在载玻片上，然后转移到共聚焦显微镜下观察。用561nm diode-pumped solid state laser line观察，用565nm-605nm宽带滤片来检测发射光。

◇◇ 外泌体染色结果分析

针对几种染色流程，发现①超速离心为基础的外泌体染色会产生大量的PKH26纳米粒子（nanoparticles），直径类似于PKH26标记的外泌体。②基于过滤（filtration）为基础的外泌体染色法典型的特征是PKH26标记颗粒的回收率低。③通过蔗糖缓冲层纯化的PKH26标记纳米粒子和PKH26标记外泌体根据大小能区分开。④PKH26标记纳米粒子和PKH26标记外泌体通过进入浓缩蔗糖梯度层能分开。

摘自资料2）来自网络资源。

PKH染料（常用的有PKH26-MX4021和PKH67）大量文献用来标记外泌体和胞外囊泡进行体外和体内示踪实验。以下步骤可参考用于外泌体标记以进行微囊泡示踪实验。

外泌体标记步骤：

（1）利用超速或微过滤的方式制备新鲜的外泌体沉淀。

（2）超速离心机冷却到2-8℃。将每个样本的多管离心沉淀聚合在一起，之后测定总体积。

（3）用Diluent C, MX4022将所有体积的沉淀稀释到高达1ml。

（4）确定最大体积的沉淀样本，加等体积的不含外泌体的培养基到一个新管内，用Diluent C稀释到1ml。

（5）加6μLPKH26到1ml Diluent C管内（步骤3和步骤4）。

（6）用枪连续性轻轻混匀30s。室温静置5min。

（7）加入含2ml 10% BSA（in PBS）来淬灭反应。用无血清培养基定容体积到8.5ml。

（8）制备0.971M的蔗糖溶液。用枪缓慢吸取1.5ml蔗糖溶液，加到管子底部，确保不会产生震荡。外泌体-PKH26 MX4021标记溶液加在蔗糖缓冲层（sucrose cushion）的上方。

（9）于2-8℃超速（190,000 G）离心2h。「注意：外泌体在沉淀内，绝大部分多余的染料在中间层」。小心吸取培养基和中间层。

（10）轻轻用枪将外泌体沉淀重悬在1X PBS。

（11）转移到Amicon 10kDa MWCO超滤管内。加9ml PBS，0.75ml培养基。

（12）于3000 x g离心40min，使得最终保留体积在0.5-1mL。

（13）从Amicon超滤管内吸取浓缩液，保存在冰上。尽快于合适的仪器下分析荧光信号。

[1] Yan, F., Cui, W. & Chen, Z. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosome-Loaded microRNA-129-5p Inhibits TRAF3 Expression to Alleviate Apoptosis and Oxidative Stress in Heart Failure. Cardiovasc Toxicol 22, 631–645 (2022). https://doi.org/10.1007/s12012-022-09743-9

（染色对象：外泌体）

After thawing, the isolated MSC-Exos were labeled using a PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling (MX4023, Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China).

[2] Jiao W, Hao J, Liu JM, Gao WN, Zhao JJ, Li YJ. Mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicle-incorporated H19 attenuates cardiac remodeling in rats with heart failure. Kaohsiung J Med Sci. 2024 Jan;40(1):46-62. doi: 10.1002/kjm2.12774. Epub 2023 Oct 27. PMID: 37885317. （染色对象：细胞外囊体EV）

To observe the uptake of EV by H9C2 cells, we labeled and resuspended MSC-EV in DMEM using the PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling kit (Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) according to the protocol. 

[3] Pan G, Jiang B, Yi Z, Yin J, Liu Y. Exosomal miR-105-5p derived from bladder cancer stem cells targets for GPR12 to promote the malignancy of bladder cancer. BMC Urol. 2023 Oct 3;23(1):155. doi: 10.1186/s12894-023-01326-2. PMID: 37789353; PMCID: PMC10548737.

（染色对象：外泌体）

PKH67 staining assay

Exosome uptake of EJ and T24 cells was analyzed by PKH67 staining assay using the kit according to the manual (MX4023-100UL; Shanghai Maokang Biotech Co., Ltd.). Briefly, 2 × 10⁷ exosomes were collected and resuspended in 1 ml Diluent C. 4 μl of PKH67 solution was added into the resuspension and incubated for 5 min. Then, the PKH67-labeled exosomes were incubated with EJ and T24 cells for 24 h and the cellular location of the exosomes was observed by a fluorescence microscope. DAPI was used to stain the nuclei of the tumor cells.

[4] Wu R, Li J, Aicher A, Jiang K, Tondi S, Dong S, Zheng Q, Tang S, Chen M, Guo Z, Šabanović B, Ananthanarayanan P, Jiang L, Sapino A, Wen C, Fu D, Shen B, Heeschen C. Gasdermin C promotes Stemness and Immune Evasion in Pancreatic Cancer via Pyroptosis-Independent Mechanism. Adv Sci (Weinh). 2024 Sep 19:e2308990. doi: 10.1002/advs.202308990. Epub ahead of print. PMID: 39297408.

（染色对象：巨噬细胞）

In Vitro Macrophage Phagocytosis Assay

PBMC, immortalized Bone Marrow-Derived Macrophage (iBMDM) cells, or THP-1 cells activated with PMA (#S1819, Beyotime, 100 ng mL⁻¹ for three days) were labeled with PKH26 (#MX4021, MaokangBio), while cancer cells were labeled with PKH67 (#MX4023, MaokangBio), following the manufacturer's instructions. The macrophages were then mixed with the cancer cells at a ratio of 2:1 and seeded onto a 6-well plate. Images were taken at the indicated time points, and the phagocytic index was calculated as the number of phagocytosed cancer cells per 100 macrophages. For anti-CD47 antibody treatment, 10 µg mL⁻¹ anti-CD47 antibody or isotype IgG was added to the co-culture medium of CHX2000 cells and iBMDM cells at a 1:1 cell ratio. Cancer cell confluence was determined by fluorescent imaging and quantification.

[5] Yao F, Zhao Y, Wang G, Zhao M, Hong X, Ye Z, Dong F, Li W, Deng Q. Exosomal lncRNA ROR1-AS1 from cancer-associated fibroblasts inhibits ferroptosis of lung cancer cells through the IGF2BP1/SLC7A11 signal axis. Cell Signal. 2024 Aug;120:111221. doi: 10.1016/j.cellsig.2024.111221. Epub 2024 May 8. PMID: 38729321.

（染色对象：外泌体）

Exosomes and PKH67 (MX4023, MaoKangBio, Shanghai, China) were diluted, respectively, using diluent C (1 mL, MX4022, MaoKangBio).

[6] DnaK of Parvimonas micra OMVs interacted with the host fibroblast Bag3-IKK-γ axis to accelerate TNF-α secretion in oral lichen planus

Besides, they underwent overnight incubation at 4°C with antibodies against pkh67 (maokangbio, Shanghai, China), β-Tubulin (CST, California, the USA), Bag3 and IKK-γ, and then 1-hour incubation with Alexa Fluor 488/594-labelled goat anti-mouse/rabbit immunoglobulin G (IgG) (Abbkine, California, the USA) at 37°C in the dark.

[7] Wang H, Chen L, Li R, Lv C, Xu Y, Xiong Y. Polydopamine-coated mesoporous silica nanoparticles co-loaded with Ziyuglycoside I and Oseltamivir for synergistic treatment of viral pneumonia. Int J Pharm. 2023 Oct 15;645:123412. doi: 10.1016/j.ijpharm.2023.123412. Epub 2023 Sep 12. PMID: 37703956.

The PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (MX4023) was purchased from Maokang Biotechnology Co. Ltd. (China). 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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