Plant Protoplast Isolation and Transformation Kit II (PEG-Mediated)

 植物原生质体分离与转化试剂盒II（PEG法）

产品关键词：

Plant Protoplast 植物原生质体；PEG-mediated protoplast transformation 聚乙二醇介导的原生质体转化；Yakult Honsha；Cellulase R-10纤维素酶R-10；Macerozyme R-10离析酶R-10；二乙酸荧光素(FDA) 原生质体活力检测；

产品信息

【温馨提示】：见我司（MKBio）整理的植物细胞壁降解酶/消化酶产品专题。

产品描述

原生质体（Protoplast）是指植物细胞去掉细胞壁后的裸露部分，体外培养条件下，具有以下功能：1）具全能型，可再生细胞壁，进行连续的细胞分裂且能再生成完整植株的能力；2）具摄取外源大分子、细胞器，以及细菌、病毒的能力，从而原生质体是进行遗传操作，基因转移的良好材料；3）通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，从而培育出具有抗病原或更高产量的新品种。本试剂盒利用的是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（不包含

原生质体（Protoplast）的制备最主流的技术是酶解法，因其具有消化温柔，操作简单，且良好维持原生质体完整性的特点。工作原理是根据植物细胞壁的结构特征选择合适的酶进行处理，植物细胞壁主要由多糖（纤维素、半纤维素、果胶等）以及少量的蛋白和脂质构成。因此，通过使用纤维素酶、离析酶、半纤维素酶、果胶酶等复合酶来降解细胞壁，即可得到原生质体。

原生质体（Protoplast）的转化方法很多，主要有PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法、农杆菌共培养转化法等。

本试剂盒是PEG介导的原生质体转化法，操作简单和便捷。试剂盒含有植物原生质体制备（包含消化酶和细胞筛网）和植物转化需要的所有试剂。原生质体制备，按照单次5ml酶液体系来算，可做40次酶消化反应；原生质体转化，按照每次转化100μl原生质体溶液，可做至少40次转化。

试剂盒组分

保存与运输方法

保存：按照说明书要求对各组分进行归位保存，1年有效。 

运输：室温运输。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 需要准备材料

1.1 平头镊子

1.2 一次性刀片

1.3 1.5ml离心管

1.4 50ml离心管

1.5 恒温加热水浴锅

二、 原生质体分离

2.1 按照以下表1，配制即用型酶溶液：【注意：此溶液现配现用】

【注①】：依次加入表中各组分，若有需要，也可以在加入纤维素酶R-10之后，于55℃水浴10min，中间颠倒混匀2-3次。冷却到室温后再加入后续组分。此步一方面促进酶溶解，一方面能灭活DNase和蛋白酶。

2.2 取生长状态良好的叶片切成0.5-1mm的小条，按照0.1g叶片（以拟南芥为例，0.1g重约15-20个叶片）加5ml即用型酶溶液的比例迅速将切好的叶片小条浸泡于即用型酶溶液内，室温避光酶解3h，间歇混匀。

【注①】：叶片与即用型酶溶液的使用比例亦可根据实际的酶解效率进行优化调整。

【注②】：酶解时间与叶片类型、叶片生长状态有关，请根据实际实验进行调整。【条件允许的话可以使用微型真空泵室温避光条件下抽真空30min，以使酶溶液更好的进入细胞间隙】。酶溶液变为绿色表明有原生质体已经分离，变为浓绿色表明有大量原生质体已经分离。显微镜镜检确定是否分离。叶片原生质体在显微镜下为绿色圆球状，叶绿体分散在细胞内，说明状态良好；如果呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎。

2.3 酶解后加入等体积的溶液B（比如：使用5ml 即用型酶溶解液，则加入5ml 溶液B），轻柔混匀。

2.4 用70μm细胞筛网过滤步骤2.3获得的溶液，去除未消化的叶片和杂质，收集滤液到50ml离心管内。

2.5 滤液于100×g，室温离心2min，尽量吸掉上清。

【注①】：建议整个实验过程使用水平转头，以避免原生质体在离心时贴在管壁。离心时降低离心机的升速和降速，升速过快，可能导致原生质体离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。

2.6 加1ml溶液B重悬原生质体，冰浴30min，使得原生质体自然沉淀到底部。

2.7 小心吸掉上清，不要触动原生质体沉淀。将沉淀重悬于1ml溶液C，即得到原生质体溶液。

三、 原生质体转化

3.1按照以下表2，根据实际样品量配制所需的即用型转化溶液D，需在转化开始前至少1h配制转化溶液，以确保转化试剂能充分的溶解。转化溶液建议配制当天使用。配制好的转化溶液于4℃保存3-5天内会维持相对较好的转化效率，但与现配的转化溶液相比，转化效率会有一定程度的下降。

3.2取10μl质粒DNA（10-20μg，浓度为1-2μg/μl）于1.5ml离心管。

【注①】：质粒大小建议在5-10kb，质粒浓度建议在1-2μg/μl。原生质体转化对质粒的纯度要求较高，尽量使用高纯质粒。

3.3 加入100μl原生质体溶液（原生质体密度为2×105个/ml，约2万个原生质体），轻柔混匀。

3.4 加入等体积（110μl）新鲜配制的即用型转化溶液D，轻柔完全混匀，室温孵育5-15min，间歇轻柔混匀。

【注①】：通常孵育5min足够，但需要根据实际体系来优化调整，最长孵育15min。

3.5 加入2倍体积（440μl）溶液B，轻柔完全混匀，终止转化过程。

3.6 于100×g，室温离心2min，尽量吸掉上清。

【注①】：由于转化后的溶液非常粘稠，加入溶液B后离心1min通常可以使得原生质体聚集在管底，但是，使用某些突变体时为了减少原生质体损失，可以延长离心时间到2min。

3.7 加入500μl溶液B轻轻重悬原生质体，于100×g，室温离心1min，吸掉上清。此步目的是为了充分去除转化液内残留组分，避免后续可能产生的负面影响。

四、 原生质体培养和收集

4.1 原生质体溶液室温孵育2-16h。

【注意】：根据特定实验确定孵育时间。RNA分析一般孵育2-6h；酶活性分析和蛋白标记一般孵育2-16h。

4.2 于100×g，室温离心2min收集原生质体，去掉大部分上清。

4.3 原生质体沉淀重悬于剩余溶液中，-80℃保存。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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