Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯

（长波长的可见光钙离子探针）

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重要提醒（购买或初次使用前）请务必查阅：

【务必注意】：初次使用离子探针的用户，强烈建议配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 细胞培养级（MS4301-1G）一起使用，以提高探针的水溶性和胞内加载性。 

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搜索关键词：

Rhod-2 AM Cell Permeant 钙离子荧光探针；Rhod-4, AM；Fluo-8； Fluo-4； HTS Screen Assay 高通量筛选；

订购信息：

产品描述

Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca2+荧光探针。类似于Fluo-3或Fluo-4，其激发和发射光谱不会随着Ca2+浓度变化发生明显的迁移，荧光信号一旦与Ca2+结合后明显增强。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波长更长（Ex/Em=549/578 nm），这一特性使其更适合具高水平自荧光信号细胞或组织的Ca2+水平检测，还可用来检测由光感受器和笼锁Ca2+螯合剂光激活导致的Ca2+释放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-2，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

主要特征：

1）   长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容；

2）   特别定位在线粒体。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察加载进入细胞呈现点状染色模式。有文献认为，Rhod-2是线粒体Ca2+的选择性探针，不过这一理论并未得到广泛支持。

3）   检测平台：荧光成像，流式细胞术，酶标仪，高内涵筛选（HCS）

基本特性：

1）   CAS NO：129787-64-0

2）   化学名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3）   同义名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester 

4）   分子式：C52H59N4O19Br

5）   分子量：1123.96

6）   外观：红色固体

7）   最大激发/发射波长：549/578 nm

8）   Kd（Ca2+结合）：570NM

9）   溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

10）化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

运输：室温运输。

注意事项

1）   荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）   Rhod-2从低浓度Ca2+到高浓度Ca2+的荧光增强程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的荧光信号弱于Fluo-3。

3）   乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

4）   Rhod-2, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

5）   Rhod-2, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

A， 试剂准备

1）  配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末（货号：MS4301-1G）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1）   用无水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Rhod-2, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Rhod-2, AM中加入11.1µl 无水DMSO）。准备Rhod-2, AM工作液之前，有时需要往Rhod-2, AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

2）   用HHBS或其他生理缓冲液将 Rhod-2, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Rhod-2, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）  【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4） 将准备好的Rhod-2, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod-2, AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

【注②】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注③】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6） 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7） 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=549/578 nm来进行检测。

Rhod-2 AM的应用实例：

1）   应用目的：用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM（MX4507-50UG）检测顺铂（cisplatin）敏感SKOV3细胞和顺铂耐性SKOV3/DDP细胞内线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 1. 顺铂或ATP处理诱导SKOV3细胞线粒体Ca2+内流，并非SKOV3/DDP细胞。A）两种细胞系分别用ATP诱导处理，时间序列扫描检测线粒体Ca2+变化，通过共聚焦显微镜得到数据。B）细胞用6 μg/ml顺铂处理0h，8h和16h后用共聚焦显微镜检测（bar，20 μm）。

2）   应用目的：用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM（MX4507-50UG）检测顺铂（cisplatin）对HeLa细胞线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 2. 顺铂增加细胞浆和线粒体内游离Ca2+水平。A）HeLa细胞用顺铂（2.5, 5 or 10 µg/ml）处理0h，6h，12h和24h后，用荧光钙离子探针Fluo-4 AM孵育。细胞浆Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察（bar，40 μm）。B）Fluo-4 AM定量检测细胞浆内游离Ca2+水平。C）HeLa细胞用顺铂（2.5, 5 or 10 µg/ml）处理0h，6h，12h和24h后，用荧光钙离子探针Rhod-2 AM孵育。线粒体Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察（bar，40 μm）。D）Rhod-2 A定量检测线粒体内游离Ca2+水平。

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——Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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引用文献

[1] Yi, L., Shang, XJ., Lv, L. et al. Cadmium-induced apoptosis of Leydig cells is mediated by excessive mitochondrial fission and inhibition of mitophagy. Cell Death Dis 13, 928 (2022). https://doi.org/10.1038/s41419-022-05364-w

The concentration of mitochondrial Ca²⁺ in TM3 cells was determined using a fluorescent Ca²⁺ indicator Rhod-2 AM (Maokang Biotechnology, China). The cells were loaded with HBSS buffer (without Ca²⁺ and Mg²⁺) containing 4 µM Rhod-2 AM and incubated at 37 °C for 30 min in the dark. The cells were washed and incubated with HBSS buffer for 30 min. Cellular images were captured using a confocal microscope (Olympus, Japan).

[2] Che S, Chen S, Li S, Ruan Z. Decabromodiphenyl ether initiates mitochondria-dependent apoptosis by disrupting calcium homeostasis in mice livers. Chemosphere. 2022 Mar;291(Pt 1):132767. doi: 10.1016/j.chemosphere.2021.132767. Epub 2021 Nov 5. PMID: 34748805.

Mag-Fluo-AM and Rhod-2AM (Maokang Biotech, Shanghai, China) probes.  Mag-Fluo-AM monitors ER Ca2+ concentration, and Rhod-2AM indicated mitochondrial Ca2+ level. Cellular images were acquired by using the Operetta CLSTM High Content Analysis System (PerkinElmer, Massachusetts, USA) or an inverted fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti-SR, Tokyo, Japan).

[3] Xie K, Liu L, Wang M, Li X, Wang B, Yin S, Chen W, Lin Y, Zhu X. IMPA2 blocks cervical cancer cell apoptosis and induces paclitaxel resistance through p53-mediated AIFM2 regulation. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2023 Apr 28;55(4):623-632. doi: 10.3724/abbs.2023069. PMID: 37140233; PMCID: PMC10195139.

Measurement of the intracellular Ca 2+ concentration

The mitochondrial Ca 2+ concentration was detected using a Rhod-2 AM probe (Maokang, Shanghai, China). Detection was carried out according to the manufacturer’s instructions, immunofluorescence signals were examined using the A1 fluorescence microscope, and ImageJ was used for fluorescence quantification.

[4] Zhang S, Lv Y, Luo X, Weng X, Qi J, Bai X, Zhao C, Zeng M, Bao X, Dai X, Zhang Y, Chen Y, Liu M, Hu S, Li J, Jia H. Homocysteine promotes atherosclerosis through macrophage pyroptosis via endoplasmic reticulum stress and calcium disorder. Mol Med. 2023 Jun 12;29(1):73. doi: 10.1186/s10020-023-00656-z. PMID: 37308812; PMCID: PMC10262416.

Calcium detection

The levels of cellular calcium and mitochondrial calcium were measured by Fluo-4, AM (Beyotime, China) and Rhod-2, AM (Maokang, China) according to the manufacturer’s instructions, respectively. After treatment, the cells were washed with PBS for 3 times and incubated with working solution for 30 min in the cell incubator. The results were observed by the fluorescent microscope.