Acetosyringone乙酰丁香酮/农杆菌介导的转化增强剂
搜索关键词：Acetosyringone 乙酰丁香酮；Natural phenolic compounds 天然酚类化合物；Vir（virulence）基因；Agrobacterium-Mediated Transformation 农杆菌介导的转化研究；GUS瞬时表达；X-Gluc；CAS：2478-38-8
基本介绍：
乙酰丁香酮（Acetosyringone，CAS：2478-38-8），也称为4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮（4'-Hydroxy-3',5'- dimethoxyacetophenone），一种由受伤的植物细胞分泌的天然合成酚类化合物，最为熟知的生理功能是参与植物-病原菌识别过程。乙酰丁香酮可提高植物转化效率，作用机制在于其能诱导农杆菌Vir基因的转录和高效表达，刺激T-DNA转化并且整合进入植物基因组内。还可用于合成4-甲氧基查尔酮及其类似物，体外用作抗肿瘤药。
乙酰丁香酮与农杆菌介导的植物遗传学研究：
作用机制：诱导农杆菌Vir基因的转录和高效表达，刺激T-DNA转化并且整合进入植物基因组内。【因此，需先用乙酰丁香酮诱导刺激一段时间，再进行转化实验】。
常用工作浓度：50-200 μM。
使用案例：
1. Agobacterium-mediated transformation of C. graminicola（农杆菌介导的真菌转化）
1.1 乙酰丁香酮储存液制备方法：称取392.4mg 乙酰丁香酮（Mw：196.2g/mol）溶于12ml 95%乙醇，之后加入8ml 无菌水，混匀后，即得到100mM储存液。滤膜过滤除菌后，-20℃分装冻存。
1.2 转化步骤：
S1：将已经转化有质粒的农杆菌（Agro）接种到添加有50mg/ml卡那霉素（按照500μl/500ml培养基）的LB固体培养基，29° C倒置培养48h。使用质粒-农杆菌为：pRAN-AgL-1.
S2：使用无菌接种环，挑取快速生长的农杆菌克隆到5ml MMB肉汤（minimal media broth），添加有5 µl 硫胺（1g/ml储存液）和5 µl 卡那霉素（50mg/ml储存液）。29° C摇床上震动培养48h，230-250rpm。
S3：吸取150-200µl 上述培养物到5ml 诱导培养液（IM，Induction Media），添加有10 µl 乙酰丁香酮（AS，100mM储存液）和5 µl 硫胺（1g/ml储存液）。29° C于230-250rpm摇床上震动培养约6h，直至OD600至少达到0.25。
S4：吸取300µl 上述Agro-IM培养物和100µl 真菌孢子（浓度约106孢子/ml）到1.5ml离心管内共培养。此时可将管子在工作台上放置一会，此时需要将小片NC滤片（Millipore 0.45µm HA）铺到固体的IM培养基上，添加有200 µl 乙酰丁香酮（AS，100mM储存液）和100 µl 硫胺（1g/ml储存液），这个过程约20-25mins。
S5：吸取200-400ul共培养Agro/孢子到NC片膜上，并用无菌玻璃棒或无菌塑料片涂布均匀。将平板放到工作台或者常规真菌转化用的生长区域进行孵育2-5天。对照组只涂布孢子悬液到NC膜片上。
S6：使用无菌镊子转化12个上述培养的NC膜片到PDA培养基上，添加有噻孢霉素（终浓度：200µg/ml），羧苄青霉素（终浓度：250µg/ml），潮霉素B（终浓度：250µg/ml）。室温或者真菌生长需要的温度进行培养。
S7：最后将转化好的克隆接种到含有潮霉素B（终浓度：250µg/ml）的PDA培养基。
2. Agobacterium-mediated transformation of Rice（农杆菌介导的水稻转化）
2.1 乙酰丁香酮储存液制备方法：称取392 mg 乙酰丁香酮（Mw：196.2g/mol）溶于20ml DMS，充分溶解混匀后，即得到100mM储存液。-20℃分装冻存。
2.2 转化步骤：
S1：种子愈伤组织诱导：种子（Oryza sativa L. ssp japonica cvs. Millin or Nipponbare.）经消毒，清洗，滤干后放到2N6培养基（按照12-15颗种子/平板）。使用3-4周的时间来进行愈伤组织的诱导和增殖。一般情况，millin需要3周，Nipponbare需要4周；
S2：愈伤组织亚培养：将胚性愈伤组织分成大小约2.5mm的组织片，转移到新鲜的2N6培养基上继续培养7-10天；
S3：细菌培养物活化：转化前2-3天接种细菌培养物到合适的YM固体平板上活化；
S4：转化：
1）将细菌培养物重悬到AAM培养液（含有100 µM 乙酰丁香酮）。将菌体从平板上刮下来或者用AAM培养液洗脱下来，震匀，使其OD600约为1.0。
2）将重悬好的菌液室温条件放置2-3h。【此过程是为了让乙酰丁香酮诱导农杆菌内vir基因的转录启动和高效表达，以充分发挥转化增强剂的作用。】
3）转移到一更大的容器内，之后往内加入胚性愈伤组织。室温条件旋转并将组织培养约40mins。
4）无菌滤纸上吸干后，将组织转移到2N6-AS平板上。
5）黑暗条件下于26° C共培养2-3天（A. tumefaciens）或7天（S. meliloti)）。
S5：愈伤组织清洗：目的在于清洗愈伤组织以去除未转化的农杆菌；将清洗好的愈伤组织加入2N6-TCH平板上，含有Claforan，Timentin抗生素，用来杀死残留农杆菌；和潮霉素B，用来筛选；
S6：筛选步骤：每两周将愈伤组织转移到新的2N6-TCH平板，因筛选抗生素给予的压力，愈伤组织会由浅褐变为深褐色。对于成功转基因的潮霉素B抗性愈伤组织经过2-4周筛选后会开始生长，呈乳白色。将这类组织重新转到2N6-TCH培养基，再培养2周。之后可进行GUS活性表达研究。
S7：再生：当组织开始变大，可转移到再生培养基RGH6，此时组织呈现乳白色。将组织黑暗条件培养1周后，再转移光亮处培养。
S8：植株形成：1-2周之后，会发现愈伤组织变绿，然后芽开始分化。
乙酰丁香酮基本特性：
1） 同义名：4'-Hydroxy-3',5'- dimethoxyacetophenone 4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮；3′,5′-Dimethoxy-4′- hydroxyacetophenone 3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮；
2） CAS NO：2478-38-8
3） 分子式：C10H12O4
4） 分子量：196.20 g/mol
5） 纯度：≥98%
6） 熔点：124-127° C (lit.)
7） 外观：灰白色至黄褐色粉末或结晶
8） 溶解性：微溶于水，溶于DMSO，乙醇和甲醇
9） 化学结构式：
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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MS5509-1G |
Acetosyringone 乙酰丁香酮 |
1g |
225 |
现货 |
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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MS0616-25G |
Vitamine B1 (Thiamine Hydrochloride) 盐酸硫胺 |
25g |
60 |
现货 |
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MS0019-10G |
Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素 |
10g |
150 |
现货 |
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MS0029-1G |
Cefotaxime Sodium Salt 噻孢霉素钠（头孢噻肟钠） |
1g |
85 |
现货 |
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MS0003-1G |
Hygromycin B 潮霉素B（冻干粉） |
1g |
600 |
现货 |
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MS0003-20ML |
Hygromycin B (50 mg/ml) 潮霉素B（50 mg/ml） |
20ml |
820 |
现货 |
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MF2004-100MG |
X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐 |
100mg |
350 |
现货 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
