X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐（X-beta-D- glucuronide CHA salt）
——转基因植物最常用报告基因GUS显色底物，GUS染色定性研究
搜索关键词：β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）,蓝色显色底物,转基因植物GUS表达, GUS染色（定性）,报告基因gusA（uidA）,活性检测, CAS：114162-64-0
作用机制：
X-Gluc，也称为5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸），是β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的显色底物，由一种广泛使用的报告基因gusA（uidA）所编码。GUS水解X-Gluc，生成一种无色的葡萄糖醛酸和一种肉眼可见的氯-溴靛蓝（chloro-bromoindigo）深蓝色沉淀。利用这一特性，X-Gluc常用来检测植物细胞和组织中的GUS表达；另外，X-Gluc还能用来检测大肠杆菌引起的感染状况；或检测食物或水源是否受细菌污染。
主要应用：转基因植物报告基因GUS活性检测，X-gluc用作显色底物。
普遍应用优势在于：绝大多数植物细胞内不存在内源性的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高，易于定量及定性分析，能够与其他蛋白质基因融合等优势，因此，GUS基因为植物工程研究中应用最广泛的报告基因（报道基因）之一。
1. GUS活性检测（组织化学定位法，定性研究）
GUS催化底物X-gluc在酶活性位点生成深蓝色沉淀，为研究外源基因在植物中表达具体部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和显色产物非常稳定，植物中可以积累。
1.1 GUS染色液制备【作为参考，可按照具体实验条件来调整】
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试剂名称 |
配制方法 |
用量 |
备注说明 |
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X-Gluc储存液（10mg/ml） |
溶解1mg X-gluc于0.1ml甲醇，低速漩涡充分溶解； |
100μL |
最早实验使用DMF作为X-gluc溶剂，但是有研究发现DMF会抑制GUS活性，使用甲醇作为溶剂可将GUS活性提高25%。 |
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2x buffer |
磷酸盐缓冲液pH 7.0 (0.1 M NaH2PO4/0.1 M Na2HPO4)； 柠檬酸-盐酸溶液pH 7.0 (0.1 M sodium citrate/ 0.2 N HCl)； |
1ml |
体外X-gluc活性（荧光定量染色）显示，使用柠檬酸盐酸溶液可将GUS活性提高20%。
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0.1 M potassium ferrocyanide |
将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml。 |
20 μL |
亚铁-/铁-氰化钾的最佳工作浓度需要摸索，建议最好起始工作浓度为1 mM。 |
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0.1 M potassium ferricyanide |
将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。 |
20 μL |
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10% Triton X-100 |
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10 μL |
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H2O |
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850μL |
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1.2 GUS定性染色步骤
a）于预冷固定液（4%多聚甲醛溶液，新鲜制备）固定样本30min，偶尔摇晃或置于低速摇床上固定；
b）使用预冷的1×磷酸盐或柠檬酸盐酸溶液清洗固定样本30-60min，中间更换几次清洗液；
c） 真空渗透法将X-Gluc染色液加入待染色样本【对于组织培养的拟南芥不需用真空渗透；】黑暗条件室温或者37°C孵育几小时或过夜，或者明显的蓝色沉淀出现（不超过24h）；
d）去离子清洗染色样本；
e） 对于绿色样本，使用70%乙醇脱色直到叶绿体完全去除，然后转移到去离子水内清洗；对于种子或其他样本，参考文献An Improved Clearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法；
f） 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。
【备注】：可直接订购我司（MKbio）提供的GUS染色试剂盒（组织化学法） ，经济实惠，使用方便，节省溶液配制的大量麻烦步骤。
2. GUS活性检测（荧光分析法，定量研究）
GUS催化荧光底物MUG 4-甲基伞型酮-beta-D-葡糖苷酸，将其水解为4-MU（4-甲基伞型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羟基解离后在365nm的光激发下产生455nm的荧光。此时用荧光分光光度计测定得到的是相对值，因此同时需要用标准物4-MU进行校准。
荧光定量分析GUS活性有两种基本方法：1）在一个时间点测定GUS酶作用产物的总荧光量，需要设定空白对照，以消除内源荧光强度；2）测定一段时间内GUS的动力学过程。在酶反应初始阶段，酶作用产物与时间呈线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无线性关系。由此可计算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白质。有时也可以用样本的鲜重来表示。
a）取约100mg愈伤组织或一片新鲜叶盘于1.5ml离心管内，加入100μl萃取缓冲液（extraction buffer）内匀浆。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。
萃取缓冲液（extraction buffer）配方：50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100
b）4°C，15,000rpm离心5min。收集上清转移到另一干净的1.5ml离心管，冰上放置待用。
c） 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C预热的反应缓冲液（Assay buffer）；用移液枪吹匀或漩涡混匀。
反应缓冲液（Assay Buffer）：称取17.6mg MUG溶于50ml萃取缓冲液，此时即为1mM MUG反应液。4°C保存，2周稳定。
d）在某一时间段内（高GUS活性样本30min；或低GUS活性1h-过夜；）吸取100μl溶液到含900μl终止液（Stop Buffer）的1.5ml离心管内，做好标记。有可能采集3-4个时间点和过夜孵育的时间点荧光量。【用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。】
e）以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。
基本特性：
1）CAS NO：114162-64-0
2）英文同义名：5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt;X-beta-D- glucuronide CHA salt;X-Gluc CHA Salt; X-glu CHA Salt; X-glcA CHA Salt; BCIG CHA Salt;
3）分子式：C14H13BrClNO7 • C6H13N
4）分子量：521.79g/mol
5）纯度：＞99%（HPLC）
6）外观：白色至类白色结晶性粉末
7）溶解性：DMF、甲醇
8）化学结构式：
产品订购：更大包装或产品技术问题，请来电/在线咨询，电话：021-54736159 。网站：www.maokangbio.com。
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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MF2004-100MG |
X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐 |
100mg |
350 |
现货 |
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MF2004-1000MG |
X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸环己胺盐 |
1g |
1800 |
现货 |
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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MF2005-250MG |
250mg |
580 |
1-2周 |
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MF2005-1000MG |
1g |
1580 |
1-2周 |
【提示】可直接订购我司代理的Markergene GUS reporter gene activity kit，原装正品，欢迎咨询。
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。
