D-luciferin D-荧光素/D-荧光素钾盐/D-荧光素钠盐常见问题
1. D-荧光素（D-luciferin）适合用于哪些实验？
作为萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的作用底物，常常用于以下实验，
1） 体内活体成像In vivo imaging；荧光素酶标记的肿瘤细胞、干细胞或传染疾病通常注射入研究动物模型比如大小鼠内进行研究，从而对动物模型进行实时和非侵略性的监测疾病进程和/或药效。
2） 体外研究In vitro study，包括荧光素酶和ATP水平分析；报告基因分析；高通量测序和各种污染检测。
2. D-荧光素（D-luciferin）的作用原理如何？
作用机制：在ATP和荧光素酶的作用下，D-荧光素（底物）被氧化发光。当荧光素过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性（见下图）。
机理阐释（体内）：荧光素酶（Luc）催化底物D-荧光素，利用ATP和Mg2+作为辅因子，氧气存在下发射一典型的黄绿光，之后在体内37℃下迁移到红光。
机理阐释（体外）：很多因素都可能影响反应灵敏性，包括温度、pH或底物浓度。建议使用pH 7.8的缓冲液，并且使用前将所有试剂预热到室温。建议反应缓冲液内添加过量的ATP和Mg2+以达到最佳反应状态。
3. 甲虫荧光素（Beetle luciferin）和荧光虫荧光素（Firefly luciferin）之间有差别？
两者之间没有差别，仅是不同公司命名上的差异，化学结构一致。
4. 荧光素（luciferin）如何溶解，稳定性如何？
很多文献和一些客户提及用水溶解D-荧光素，之后置于-80℃分装冻存，基本没有明显毒性效应。钾盐溶解性通常是60mg/ml，而钠盐溶解性高达100mg/ml（游离酸不溶于水，但溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml）。但是，关于溶解的D-荧光素稳定性存在争议报道，可能由于水中含有的氧气而破坏稳定性。最好将D-荧光素溶于无气水（degassed H2O），保存效果最佳。
对最灵敏的实验，然而，强烈建议使用新鲜配制的反应液以降低实验中的可变性（比如，低浓度酶或次优温度或次优盐离子浓度可能需要高浓度底物来驱动反应完全进行）。
5. D-荧光素钾盐和D-荧光素钠盐之间有差别？
两者之间基本无差别，可能在物理特性上有些小差别，比如D-荧光素钠盐有点更颗粒状和水溶性更由于钾盐。另外，从报道文献来看约3倍多的文献用钾盐，许多研究者体内更倾向于钾盐，但任何一种效果一致。
6. D-荧光素钾盐/钠盐和D-荧光素游离酸之间有差别？
D-荧光素游离酸不溶于水，除非溶于稀碱比如NaOH或KOH调整过pH的水。溶于甲醇10mg/ml或DMSO50mg/ml。然而，D-荧光素钾盐或钠盐在实验中使用更方便，特别是体内成像，由于很容易溶于水或缓冲液，对检测系统的毒性更低。
7. 为什么D-荧光素钾盐/钠盐要溶于无Ca2+或Mg2+的PBS？其他盐溶液能用于溶解D-荧光素钾盐/钠盐?
PBS，或磷酸缓冲盐和DPBS都是生物学研究的常用缓冲盐，通常用于细胞相关的研究中。PBS/DPBS是等渗缓缓冲液（比如与人身体兼容）。这些缓冲液专门设计能提供和维持稳定pH 7.2-7.6。PBS和DPBS之间没差别，虽然后者无Ca2+/ Mg2+。钙镁溶液可能会限制胰酶活性。另外，Mg2+是催化D-荧光素生成氧化荧光素的关键成分（而Ca2+以相似的活性参与腔肠素催化）。其他盐溶液可能用来溶解D-荧光素，只要存在的阳离子不会干扰实验结果或产生脱靶效应。
8. D-荧光素在体内如何分布？
D-荧光素注射入动物体内后能快速分布且很容易分散到全身。
9. D-荧光素的体内发光动力性?
D-荧光素的给药方式很多，常用的有腹腔注射、皮下注射和静脉注射，不同的给药方式动力学曲线有差异，见下图片。对于大部分研究，腹腔/皮下注射约10-20min后达到荧光信号峰值，静脉注射约2-5min达到信号峰值。【图片来自：Bollinger, Robert Albin. Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.】
10. 动物对重复注射D-荧光素的反应如何?
D-荧光素不会影响动物（没有明显毒性或免疫反应）。
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