近期有很多客户使用我司（懋康生物）的Zymolyase-20T（酵母裂解酶，酵母溶壁酶）（Cat#：MF0212），经常问到产品如何溶解，使用剂量等问题，现对以下问题做出描述。有更多的问题，请和我司联系，或发邮件到tech@maokangbio.com。
常见问题（Frequently asked questions）：
一、 产品如何保存？
答复：本品以冻干粉形式提供，收到产品需2-8℃干燥保存。本品置于30℃，3个月酶活力损失约70%。本品溶于缓冲液配制成储存液后，短期置于2-8℃保存，约2周稳定。长期请置于-20℃保存，约数月稳定。
二、 冻干粉如何溶解？
答复：本品易溶于水。建议用1/15M phosphate buffer（pH 7.5）溶解，或用自己实验体系相关缓冲液来溶解。储存液的制备方法比较多，主要根据自身的实验体系，或参考文献来操作。短期置于2-8℃保存，约2周稳定。长期请置于-20℃保存，约数月稳定。
三、 如何制备无菌酶溶液？
答复：若需要制备无菌酶溶液，请用除硝酸纤维素膜之外的0.22µm孔径的滤膜过滤除菌。
四、 酶的比活力是多少？
答复：Zymolyase-20T指的是酶的比活力约20，000 units/g (20 Ku/mg)，具体批次酶的比活力是有变化的，详细请见产品标签或质检报告。
五、 Zymolyase适用于哪些菌株类型？
答复：该酶的裂解谱（lytic spectrum）包含以下菌属：Ashbya（阿舒囊霉属）, Candida（假丝酵母菌属）, Debaryomyces（德巴利（氏）酵母属）, Eremothecium(假囊酵母属), Endomyces(内孢霉), Hansenula(汉逊氏酵母), Hanseniaspora(孢汉逊酵母属), Kloeckera(克勒克酵母属), kluyveromyces（克鲁维酵母属）, Lipomyces(油脂酵母属), Metschnikowia(梅奇酵母属), Pichia(毕赤酵母属), Pullularia(芽霉菌属), Torulopsis(球拟酵母菌), Saccharomyces(酵母属), Saccharomycopsis(复膜酵母菌属), Saccharomycodes(类酵母属), Schwanniomyces(许旺酵母菌属)，等等。其他未罗列在内的菌属请查阅文献或和我司联系是否有相关应用数据。
六、 Zymolyase适用于丝状真菌吗？
答复：该酶主要用于酵母细胞壁的裂解，对于丝状真菌，虽然与酵母细胞壁在结构上有很多相似，但裂解效果因菌株类型有差异。建议用复合酶的形式来特异裂解丝状真菌，或选用我司（懋康生物）提供的真菌溶壁酶（Cat#:MX7356）。
七、酶的工作浓度一般是多少？
不同的酵母菌株对酶的敏感性会有差异，请参阅文献或根据实际的裂解经验来设定合适的工作浓度。操作方法可参考下方流程。
操作步骤（仅作参考，实际应用可做适当调整）：
一、Zymolyase-20T储存液制备
此配制方法针对以下步骤来设置，也可以适用其他适当的溶剂如1/15M phosphate buffer(pH 7.5) 、10mM Tris-HCl buffer（pH 7.5）等。
将低温保存的冻干粉从冰箱取出，回置室温，低速离心后，称取适量粉末溶于无菌S缓冲液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）配制成10mg/ml（200U/ml）储存液，置于4℃能稳定保存2周（无菌条件下）。
二、制备原生质球（Spheroplasting protocol）
2.1 室温条件，5000rpm（3000 xg），5min离心酵母培养物；
2.2 吸掉上清，收集离心沉淀（酵母细胞），记录湿重；
2.3 用TE缓冲液（100 mM Tris，pH 8.0，100 mM EDTA）重悬酵母细胞，按照1.4ml/g湿重细胞加量。并用去离子水定容到终体积 3.5ml/g湿重细胞。
2.4 按照17.5 μl/g湿重细胞加入ß -巯基乙醇，目的是为了除去细胞外层甘露聚糖层；
2.5 30°C孵育并保持低速摇晃，处于对数期生长的酵母孵育15min，处于稳定期生长的酵母孵45min；
2.7 用S缓冲液（1.0 M Sorbitol, 10 mM PIPES, pH 6.5）重悬细胞，加4.0ml S缓冲液/g湿重细胞；
2.9 再次用S缓冲液（4.0ml/g湿重细胞）重悬细胞，另加入Zymolyases（50U/g湿重细胞，对200U/ml储存液，则加入250μl）；初始用此酶，最好根据实际情况进行用量的优化。
2.10 30°C轻摇温育混合液30min，根据以下方式监测原生质球形成程度：
a）加1μl样品到20μl S 缓冲液内，原生质球应该保持完整；b）加1μl样品到20μl去离子水中，原生质球应该破裂；显微镜下观察比较两个样品。
2.11 一般情况下反应45-60min，原生质球的形成量>90%，此时4oC下离心收集细胞，5000rpm，5min；
2.12 再次用S缓冲液（2 ml/g湿重细胞）重悬原生质球，5000rpm离心5min；重复此步骤2次。
2.13 原生质球沉淀可置于-70oC冻存。
三、酵母基因组DNA的制备（Preparation of yeast genomic DNA）
以下操作步骤简单快速，适合于少量酵母培养物内基因组DNA的制备。
3.1 将过夜培养的10ml酵母菌培养物离心收集沉淀，加入280μl TE Buffer，300 μl 去离子水和3 μl ß -巯基乙醇；
3.3 30oC温育45min；
3.3 以台式离心机的最高速度离心2-3s，弃上清液，沉淀用500μl S 缓冲液重悬.；再次离心弃上清；
3.4 用500μl含有1 mg/ml Zymolyase 20T的S缓冲液重悬沉淀（或者使用自行优化后的最佳酶浓度）；
3.5 30oC温育1h；
3.6 重复步骤3.3；
3.7 用200μl含有0.1%SDS和2ug蛋白酶K的TE buffer重悬沉淀；
3.8 37oC温育3小时，中间时不时的混匀下溶液；
3.9 转到65oC温育20min；从水浴锅内取出并冷却至室温；
3.10 用200μl 1:1的Tris饱和酚-氯仿混合液萃取，漩涡混匀并离心；从离心机内取出并保留上清液；
3.11 用200μl氯仿萃取上清液，之后重复漩涡混匀及离心；
3.12 加入500μl 95%乙醇到上清液内，20oC沉淀10min；
3.13 4oC下，15,000 xg离心20 min；
3.14 自然风干或者于真空离心蒸发浓缩器内晾干除去多余的乙醇，并加入200μl TE缓冲液（含有150 mM NaCl和1 μg RNase A）溶解DNA；
3.15 37oC温育1小时；
3.16 重复步骤3.10和3.11；
3.17 加入2.5倍体积的95%乙醇，20oC沉淀10min；
3.18 30μl去离子水重悬DNA。对1:500的DNA稀释液测量A260，根据消光系数计算DNA产量；产量大约为40-50μg。
