活体成像研究底物之：Coelenterazine 腔肠素 - 上海懋康生物科技有限公司

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活体成像研究底物之：Coelenterazine 腔肠素

时间：2017-11-16 作者：懋康原创文章来源：懋康生物

活体成像研究底物之：

Coelenterazine 腔肠素（Rluc/Gluc报告基因）

— —活体成像研究/体外生物发光研究

搜索关键词：

Rluc 报告基因；Renilla Luciferase 海肾荧光素酶；Coelenterazine 腔肠素；D-Luciferin Sodium D-萤火虫荧光素钠盐；In vivo imaging 活体成像研究；双荧光素酶报告基因检测；CAS：55779-48-1；

基本描述：

腔肠素（Coelenterazine）是在水生生物中发现的一种发光基团（luminophore），是许多荧光素酶的作用底物，包括海肾荧光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜锚定荧光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和薮枝虫荧光素酶（Obelia luciferase），和发光蛋白包括水母发光蛋白（Aequorin）的构成之一。前者的作用原理是以腔肠素为底物的荧光素酶，在含分子氧的条件下，氧化腔肠素产生高能量的中间产物，在此过程发射蓝色光，光波长在450~480nm。不同于甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶（FLuc）系统不同，在含分子氧的条件下，还需要ATP和Mg2+的存在才能同时发光，光波长在550-570nm。由于生物发光信号和底物的差异，RLuc常常与FLuc联合用于多报告基因研究。后者的作用原理是由脱辅基水母发光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔肠素组成的复合物形成活化的水母发光蛋白（Aequorin），一旦与钙离子结合后，复合物结构被破坏，腔肠素被氧化生成高能产物（Coelenteramide），同时释放出CO2和蓝色光。

腔肠素应用甚是广泛，包括：1）活细胞或组织的钙离子检测；2）细胞或组织的超氧化物和过氧亚硝基阴离子（活性氧，ROS）化学发光检测；3）基因报告基因检测；4）动物活体检测；5）ELISA和生物发光共振能量转移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）药物高通量筛选（HTS）；

腔肠素的几个重要应用：

A、腔肠素/水母蛋白复合物用于钙离子检测（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）

A1、与传统荧光法钙离子浓度检测的优势

传统荧光法钙离子检测工具琳琅满目，由紫外光激发到可见光激发的钙离子检测，比如，Fura-2激发光比率型荧光探针，Fluo-8最亮的钙离子荧光探针，钙离子检测的灵敏度越来越高，也越来越方便，对仪器的要求也越来越低，那么腔肠素/水母蛋白系统对钙离子检测的优势在哪呢？

○ 钙离子/水母蛋白复合物（Ca2+/aequorin complex）能检测宽广范围的钙离子浓度，从~0.1μM到＞100μM。

○ 比荧光法探针的背景低，样本本身不会发生自荧光。

○ 虽然信号比荧光法低，但用成像仪能得到更高的信噪比。

○ 水母蛋白复合物（aequorin complex）不会从细胞内泄露出来，因此能监测几小时至数天内细胞钙离子（Ca2+）浓度变化。

A2、工作原理

由脱辅基水母发光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔肠素组成的复合物形成活化的水母发光蛋白（Aequorin），一旦与钙离子结合后，复合物结构被破坏，腔肠素被氧化生成高能产物（Coelenteramide），同时释放出CO2和蓝色光（~466nm）。

图1. 腔肠素/水母蛋白复合物用于钙离子检测的反应流程。

B、生物共振能量转移（BRET for assaying protein-protein interactions）

B1、工作原理

BRET是一种高级的、无破坏性和以细胞为基础的检测技术，极其适合蛋白组学研究，包括受体研究和信号转导途径的路线图。该技术是基于含生物发光荧光素酶和GFP变体融合蛋白之间的非放射性能量转移。

大部分应用中融合供体是海肾荧光素酶（RLuc），而不是水母发光蛋白（Aequorin），目的是为了避免对水母来源GFP突变蛋白的内源性亲和性。受体是黄色荧光蛋白（YFP），能够提高良种发射光间的光谱区分。当供体和受体靠近，对腔肠素衍生物底物催化降解后产生的能量从荧光素酶转移到YFP，从而使其释放自身的荧光。BRET比值的计算显示体内是否存在蛋白-蛋白相互作用，这种检测方法有效去除光输出波动可能造成数据的变动，比如由于反应体积、细胞类型、每孔细胞数目和/孔间信号延误等引起光输出波动。

B2、BRET与FRET相比的优势

荧光共振能量转移（FRET），生物发光供体被第二种荧光素所替代，其发射光谱与受体荧光素的激发光谱重叠。与FRET相比，BRET的主要优势在于：没有光淬灭或供体蛋白的光异构化，对细胞无光损伤，无光散射，或细胞或酶标板的自发荧光。因没有受体直接激发引起的光发射，BRET背景更低，允许检测更低浓度蛋白间的相互作用。

C、报告基因检测（Rluc as a reporter gene）

海肾荧光素酶（Rluc）用作报告基因以研究体内外的基因调控和功能，普遍用于多重转录报告基因检测或用作荧光虫荧光素酶转染的内参。

工作原理如下：海肾荧光素酶（RLuc），分子量为36kDa的单体蛋白，在氧气的作用下氧化腔肠素生成荧光（见图2）。Rluc不需要通过后期的翻译加工来获得活性，只需要翻译后就能用作基因报告子。

图2. 海肾荧光素酶（Rluc）催腔肠素发光的反应流程

我司（懋康生物Maokangbio）提供天然腔肠素以及几种腔肠素衍生物，它们对钙离子的亲和力，光谱特性，以及应用倾向上会有差异，详见表1—天然腔肠素及其衍生物的光谱特性，表2—天然腔肠素及其衍生物的应用差异选择适当的产品。

表1 – 天然腔肠素及其衍生物的光谱特性
产品名称	货号	Em (nm)	RLC¹	Relative Intensity²	Half-rise time (ms)³
Coelenterazine native	MX4606	466	1.00	1	6-30
Coelenterazine h	MX4607	466	0.75	16	6-30
Coelenterazine 400 a	MX4610	400	/	/	/
Coelenterazine hcp	MX4614	445	0.65	500	2-5
Coelenterazine cp	MX4613	442	0.63	28	2-5
Coelenterazine f	MX4612	472	0.80	20	6-30
Coelenterazine n	MX4615	468	0.25	0.15	6-30
Coelenterazine e	MX4611	405 & 465	0.5	4	0.15-0.3
[1] RLC = relative luminescence capacity: Total time-integrated emission of aequorin in saturating Ca2+relative to native aequorin = 1.0. [2] Ratio of the luminescence of aequorin reconstituted with coelenterazine analog relative to native aequorin at 100 nM Ca2+. [3] Half-Rise Time: The half-rise time is the time for the luminescence signal to reach 50% of the maximum after addition of 1 mM Ca2+to a standard of aequorin reconstituted with the coelenterazine analog of interest. All data are from O. Shimomura in Cell Calcium 14, 373 (1993).

表2 – 天然腔肠素及其衍生物的应用差异
产品名称	货号	应用特征
Coelenterazine native	MX4606	应用非常广泛的标准底物。腔肠素是天然水母发光蛋白复合物的发光基团，也是海肾荧光素酶（Rluc）的底物。底物的快速再生（fast regeneration）比较重要的实验推荐使用天然腔肠素。 1）生物发光检测钙离子的灵敏度非常高，检测范围从0.1µM到＞100µM；2）使用腔肠素监测报告基因表达是其主要应用；3）其他应用包括生物共振能量转移BRET，化学发光检测细胞或组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子水平（ROS）；
Coelenterazine h	MX4607	1）腔肠素h形成的水母发光蛋白复合物比天然腔肠素复合物的光强度高10倍以上；2）比天然腔肠素对钙离子敏感度更高；3）也适用报告基因分析。
Coelenterazine 400 a	MX4610	也称为DeepBlue C，是一种腔肠素衍生物，用作海肾荧光素酶Rluc的底物，发射峰约400nm。含GFP受体的BRET研究是Rluc的首选底物，因其对GFP受体的发射波干扰非常小。不可用作Gluc底物。
Coelenterazine hcp	MX4614	其生物发光强度最高（腔肠素hcp形成水母发光蛋白复合物的荧光强度比天然腔肠素复合物高190倍），对Ca2+反应速度快。
Coelenterazine cp	MX4613	Coelenterazine cp产生水母发光蛋白复合物的光强度是天然腔肠素复合物的15倍，且具有更快的Ca2+反应性。
Coelenterazine f	MX4612	腔肠素f形成的水母发光蛋白复合物的光强度是天然腔肠素复合物的20倍，最大发射波长约长8nm。具有最好的细胞渗透性。当需要具极高钙离子Ca2+灵敏度的水母发光蛋白复合物，建议用腔肠素f。
Coelenterazine n	MX4615	所有的腔肠素衍生物中荧光强度最弱，对Ca2+反应时间明显慢于天然腔肠素。一种非常有用的低灵敏腔肠素。
Coelenterazine e	MX4611	体外水母发光蛋白再生中腔肠素e的速度最高，具有双发射峰，分别为405nm和465nm，使其能在pCa 5-7范围内通过双发射峰荧光强度比率的方式测定Ca2+浓度，提高检测准确度。但由于渗透性差，不适合胞内应用。在溶液中稳定性差。

腔肠素的订购信息：

懋康生物提供非常全面的腔肠素及其衍生物产品，且有多重包装形式供应，选择性高。进口品质，保质保量，部分现货供应。欢迎来电咨询，电话：021-54736159，QQ：2971634497，1563822900。

腔肠素系列产品重要事项：

1. 腔肠素冻干粉需-20℃避光保存，且保存在惰性气体下。

2. 溶于甲醇或乙醇，不可溶于DMSO。

3. 腔肠素储存液不建议保存在-20℃或-70℃。因腔肠素是一种高能量的双杂环丁酮环状结构，即使在低温下也会自发降解。

综合以上的特征，我司懋康生物提供所有冻干粉产品都含惰性气体保证其稳定性。且多以小包装（50μg或500μg）的形式提供，以减少因单次使用不完造成的资源浪费。

货号	名称	规格	价格（元）
MX4606-500UG	Coelenterazine Native天然腔肠素	500μg	598
MX4606-1MG	Coelenterazine Native天然腔肠素	2×500μg	1018
MX4606-5MG	Coelenterazine Native天然腔肠素	5mg	2398
MX4606-10MG	Coelenterazine Native天然腔肠素	10mg	3598
MX4608-500UG	Coelenterazine h腔肠素h	500μg	928
MX4608-1MG	Coelenterazine h腔肠素h	2×500μg	1468
MX4610-500UG	Coelenterazine 400 a腔肠素400a	500μg	828
MX4610-1MG	Coelenterazine 400 a腔肠素400a	2×500μg	1380
MX4611-500UG	e-Coelenterazine腔肠素e	500μg	928
MX4611-1MG	e-Coelenterazine腔肠素e	2×500μg	1468
MX4612-500UG	Coelenterazine f腔肠素f	500μg	928
MX4613-250UG	Coelenterazine cp腔肠素cp	250μg	1482
MX4614-250UG	Coelenterazine hcp腔肠素hcp	250μg	1482
MX4615-50UG	Coelenterazine n腔肠素n	50μg	1160
MX4615-250UG	Coelenterazine n腔肠素n	250μg	3384

体内注射用腔肠素产品：

我司（懋康生物）特别提供专门用于体内动物实验研究用的注射用腔肠素产品。粉末不仅纯度非常高，且提供特别溶剂以增强粉末的溶解能力。

货号	名称	规格	价格（元）
MX4607-1MG	Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔肠素	2×500μg	1698
MX4607-5MG	Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔肠素	10×500μg	5729
MX4607-10MG	Injectable native Coelenterazine 注射用天然腔肠素	20×500μg	10800
MX4609-1MG	Injectable h-Coelenterazine 注射用腔肠素h	2×500μg	1898
MX4609-10MG	Injectable h-Coelenterazine 注射用腔肠素h	20×500μg	10800

应用示例【生物化学发光体内成像】

Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.【文献来源：Non-Invasive In Vivo Imaging of Calcium Signaling in Mice. PMC1991622】

注意事项

1）所有产品仅供科研用途，不可用做临床或诊断用途。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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