Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

细胞表面抗原免疫荧光染色（流式分析）

产品标签：

Cell surface antigen 细胞表面抗原；RBC Lysis Buffer 红细胞裂解液；TruStain FcX™ Fc受体封闭剂；Flow cytometry（FC）流式分析；cell staining buffer 细胞染色缓冲液；

背景描述：

通过荧光标记抗体和流式细胞术检测，细胞表面标记（Cell surface marker）能够用来确定细胞亚群，基于来源，发育阶段和功能。这些表面标记呈现不同形式和功能，包括识别可溶性和细胞连接配体的受体，离子通道，糖蛋白，磷脂等。比如CD4是辅助性T细胞（Th细胞）的表面标记，基于其他趋化因子受体和白细胞分化抗原标记能进一步被分类鉴定。

细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤：

此步骤做交流学习用，具体的实验方案因实验而异。

A．组织和细胞收集

1.   收集理想组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓）并制备悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞，只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）。

2.   加细胞染色缓冲液（cell staining buffer）高达~15ml，然后350xg离心5min，吸掉上清。

B．红细胞裂解

3.   用3ml红细胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min。

4.   加10ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）到管内终止细胞裂解，然后350xg离心5min，吸掉上清。

5.   如步骤2重复一次清洗。

6.   细胞计数，用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 106cells/ml，按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 105cells/ml）。

C．Fc受体封闭

7.   阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本，使用特异性结合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下，100 µl染色体积按照每106个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32)抗体，混匀，冰上孵育5-10min。

8.  人样本，每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受体封闭剂)，混匀，室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下，使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。

D．抗体的细胞表面染色

9.   按照预先优化的浓度，加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗（如：anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。

10.  至少使用2ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）清洗细胞，350xg离心5min，吸掉上清。重复一次。

11.  如果使用纯化的一抗，需在残留的缓冲液中重悬细胞，加入预先优化浓度的荧光二抗，冰上避光孵育15-20min。

12.  重复步骤10。

13.  用0.5ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）重悬细胞，每106个细胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（7-AAD Viability Staining Solution）对死细胞染色。

14.  避光冰上孵育3-5min。

15.  用流式细胞仪分析结果。

【注意】：如果不能立即使用流式细胞仪分析样品，避光保存样品，并且置于4-8℃保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间，因其会影响荧光素构象和荧光信号。

实验用产品信息：

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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