内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cell，EPC）鉴定（双荧光染色）：
DiI-Ac-LDL（红色）/FITC-UAE-I（绿色）
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▶ 内皮祖细胞（EPCs）的分离和培养
▶ 内皮细胞（EPCs）的血管新生研究
专题关键词：
EPC（Endothelial Progenitor Cell）内皮祖细胞；DiI-Ac-LDL 红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白；FITC-UAE-I/ FITC-UAE-1 绿色荧光标记荆豆凝集素；Macrophages 巨噬细胞；Scavenger receptor 清道夫受体；Macrophages 巨噬细胞；Scavenger Receptor 清道夫受体；
背景介绍：
从外周血分离得到的单个核细胞（Mononuclear Cells，MNCs），种植在细胞外基质比如纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）或明胶（Gelatin A）包被的6孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养，即可得到内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）。大量数据显示，EPCs培养过程中先后出现两种不同的分型，呈现出不同的细胞形态特征、增殖效率和生存行为。因具有不同的基因表达模式，呈现出不同的体外功能。尽管如此多差异，同样能促成体内新生血管生成（neovasculogenesis），早期EPCs分泌血管因子，而晚期EPCs用来生成大量内皮细胞（endothelial cells，ECs）。
【见表1，比较早期EPCs与晚期EPCs的特征和功能比较】
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Early EPCs 早期内皮祖细胞 |
Late EPCs 晚期内皮祖细胞 |
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细胞生理行为 Cell Biologic Behaviors |
1）原始细胞呈圆形，经3-5天培养，细胞贴壁且聚集成簇。细胞开始延伸，周边放射呈纺锤形、梭形。2周内细胞数量增加，但之后体外不再复制，4周后慢慢消失。具DiI-Ac-LDL内吞和凝集素结合性。 2）血清饥饿实验评估抗凋亡，早期EPCs和晚期EPCs都缓慢死亡，但晚期EPCs的抗凋亡能力越强。 |
1）从原始细胞开始接种后的2-4周出现更光滑的细胞质轮廓，紧紧的贴壁生长。外观类似于HUVEC的铺路石样。从几个细胞快速复制长成克隆，形成几乎100%铺满度（confluence）的单细胞层，呈现多样化的倍增效率，无衰老现象。具DiI-Ac-LDL内吞和凝集素结合性。 2）增殖速度快于早期EPCs；
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基因表达特征 Gene Expression Profiles |
早期EPCs逐渐失去CD45、CD31表达，弱表达KDR、VE-Cadherin。培养第三周，丧失VE-Cadherin、KDR表达能力。【大量研究显示，早期EPCs不同细胞标志的表达水平差异明显，可能由于其是杂合细胞群，导致难以区分。】 |
1）呈现所有内皮细胞基因的强表达，比如VE-cadherin，Flt-1，KDR，e-NOS vWF，水平同HUVEC。 2）晚期EPCs有更强的内皮细胞一氧化氮（NO）生成能力。 |
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体外功能 In vitro Function |
基质胶上早期EPCs延长细胞质极性（cytoplasmic poles），变得更长呈纺锤形，但不能形成血管样结构。 |
基质胶晚期EPCs呈强烈的小管形成能力。 |
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体内血管生成能力 In vivo Vasculogenic Potential |
早期EPCs促进新生血管生成，主要通过分泌血管因子，招募固有成熟内皮细胞和诱导增殖和分化。 |
晚期EPCs增强新生血管生成，原因在其高增殖潜能，能提供足量的内皮细胞。 |
内皮祖细胞的鉴定（双标记法）：
内皮祖细胞常用的鉴定方法有根据细胞表面表达的特异大分子（表面标志）和特有的功能。双荧光标记法就是最最常用的内皮祖细胞鉴定方法。主要利用两大特性：
1. 内皮祖细胞（EPCs），不论是早期EPCs还是晚期EPCs都能够吞噬DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）。因EPCs上含有特异性识别修饰LDL的“清道夫”受体（Scavenger receptors），吞噬DiI-Ac-LDL，导致大量带负电荷的脂质小滴进入，产生类似动脉粥样硬化斑块中发现的泡沫样细胞。而DiI保留在细胞膜上，使得细胞呈红色荧光。
2. 内皮祖细胞（EPCs），不论是早期EPCs还是晚期EPCs，能够结合凝集素（lectin）-Ulex Europaeus Agglutinin I（荆豆凝集素I），从而使细胞呈绿色。
当两种标记呈阳性的即可鉴定为正在分化的EPCs。
内皮祖细胞的鉴定（双标记法）方法和参考文献：
1. 双标记方法：为了鉴定EPCs，贴壁细胞先用2.4 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）孵育1h，用2%多聚甲醛固定，之后用10 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）孵育。荧光显微镜观察染色结果【图1 Human MNCs经定向培养后的EPCs鉴定】。
图1：荧光显微镜（40×物镜）双荧光标记细胞，结果显示A（左）为DiI-Ac-LDL阳性；A（中）为FITC-UEA-1阳性；A（右）为两种荧光结合，显示两种荧光染色重叠。
文献来源：Rehman J, et al. Peripheral Blood “Endothelial Progenitor Cells” Are Derived From Monocyte/Macrophages and Secrete Angiogenic Growth Factors. Circulation. 2003 Mar 4;107(8):1164-9.
2. 双标记方法：为了鉴定从5天G-CSF处理的大鼠外周血MNCs培养在纤连蛋白包被的培养小室玻片7
天。贴壁细胞用2.4 μl/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）120min，之后用2%多聚甲醛固定10min。用10 μg/ml FITC-UEA-1染色。
文献来源：Chen YH, et al. High Glucose Impairs Early and Late Endothelial Progenitor Cells by Modifying Nitric Oxide–Related but Not Oxidative Stress–Mediated Mechanisms. Diabetes. 2007 Jun;56(6):1559-68. Epub 2007 Mar 26.
3. 双标记方法：为了鉴定EPCs，贴壁细胞先用4 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）37°C孵育2h。PBS清洗细胞，然后用2%多聚甲醛固定10min。为了验证其与内皮细胞特异性凝集素的结合性，细胞经EDTA消化后，用50 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）4°C孵育1h。FACS分析检测效果。
文献来源：Eggermann J, et al.Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood. Cardiovasc Res. 2003 May 1;58(2):478-86.
4. 双标记方法：为了鉴定鸡EPCs，贴壁细胞先用12 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）37°C孵育4h。PBS清洗细胞，细胞清洗（5min/次，3次），然后用2%多聚甲醛固定10min。之后用10 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）室温孵育1h。共聚焦显微镜观察染色效果。
图2：荧光显微镜（40×物镜）双荧光标记观察鸡EPCs对探针的吸附能力，结果显示A：相差；B：DiI-Ac-LDL阳性（红色）；C：FITC-UEA-1阳性（绿色）；D：DiI-Ac-LDL阳性+ FITC-UEA-1阳性（双阳性，黄色荧光）；E：合并图片；
文献来源：Chunyu Bai, et al. Characterization of vascular endothelial progenitor cells from chicken bone marrow. BMC Vet Res. 2012; 8: 54.
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货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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MP6013-500UG |
红色荧光乙酰低密度脂蛋白 |
500μg |
2480 |
2-3天 |
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MP6308-500UG |
FITC-UEA-I (FITC labeled Ulex Europaeus Agglutinin I) FITC标记荆豆凝集素 |
500μg |
1280 |
现货 |
【好消息】：针对FITC-UEA-I，现特惠提供100ug（100ul）小包装，货号：MP6308-100UG，特价：560元。按照1:100（IF/ICC）的稀释比例，每张片需100ul染色工作液的条件来孵育，此规格可染100张片。
同时提供原装进口的双染色产品，订购信息如下：
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品牌 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
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Thermo（Molecular Probe） |
L3484 |
Human DiI-Ac-LDL |
200 µL |
8310 |
2-3周 |
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Sigma |
L9006-1MG |
FITC-UEA-I（FITC-UEA-1） |
1mg |
2106 |
2周 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
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