内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cell，EPC）鉴定（双荧光染色）：
DiI-Ac-LDL（红色）/FITC-UAE-I（绿色）
见内皮祖细胞/内皮细胞研究相关产品专题【请点击相关链接】
▶ 内皮祖细胞（EPCs）的分离和培养
▶ 内皮细胞（EPCs）的血管新生研究
专题关键词：
EPC（Endothelial Progenitor Cell）内皮祖细胞；DiI-Ac-LDL 红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白；FITC-UAE-I/ FITC-UAE-1 绿色荧光标记荆豆凝集素；Macrophages 巨噬细胞；Scavenger receptor 清道夫受体；Macrophages 巨噬细胞；Scavenger Receptor 清道夫受体；
背景介绍：
从外周血分离得到的单个核细胞（Mononuclear Cells，MNCs），种植在细胞外基质比如纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）或明胶（Gelatin A）包被的6孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养，即可得到内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）。大量数据显示，EPCs培养过程中先后出现两种不同的分型，呈现出不同的细胞形态特征、增殖效率和生存行为。因具有不同的基因表达模式，呈现出不同的体外功能。尽管如此多差异，同样能促成体内新生血管生成（neovasculogenesis），早期EPCs分泌血管因子，而晚期EPCs用来生成大量内皮细胞（endothelial cells，ECs）。
【见表1，比较早期EPCs与晚期EPCs的特征和功能比较】
|
|
Early EPCs 早期内皮祖细胞 |
Late EPCs 晚期内皮祖细胞 |
|
细胞生理行为 Cell Biologic Behaviors |
1）原始细胞呈圆形，经3-5天培养，细胞贴壁且聚集成簇。细胞开始延伸，周边放射呈纺锤形、梭形。2周内细胞数量增加，但之后体外不再复制，4周后慢慢消失。具DiI-Ac-LDL内吞和凝集素结合性。 2）血清饥饿实验评估抗凋亡，早期EPCs和晚期EPCs都缓慢死亡，但晚期EPCs的抗凋亡能力越强。 |
1）从原始细胞开始接种后的2-4周出现更光滑的细胞质轮廓，紧紧的贴壁生长。外观类似于HUVEC的铺路石样。从几个细胞快速复制长成克隆，形成几乎100%铺满度（confluence）的单细胞层，呈现多样化的倍增效率，无衰老现象。具DiI-Ac-LDL内吞和凝集素结合性。 2）增殖速度快于早期EPCs；
|
|
基因表达特征 Gene Expression Profiles |
早期EPCs逐渐失去CD45、CD31表达，弱表达KDR、VE-Cadherin。培养第三周，丧失VE-Cadherin、KDR表达能力。【大量研究显示，早期EPCs不同细胞标志的表达水平差异明显，可能由于其是杂合细胞群，导致难以区分。】 |
1）呈现所有内皮细胞基因的强表达，比如VE-cadherin，Flt-1，KDR，e-NOS vWF，水平同HUVEC。 2）晚期EPCs有更强的内皮细胞一氧化氮（NO）生成能力。 |
|
体外功能 In vitro Function |
基质胶上早期EPCs延长细胞质极性（cytoplasmic poles），变得更长呈纺锤形，但不能形成血管样结构。 |
基质胶晚期EPCs呈强烈的小管形成能力。 |
|
体内血管生成能力 In vivo Vasculogenic Potential |
早期EPCs促进新生血管生成，主要通过分泌血管因子，招募固有成熟内皮细胞和诱导增殖和分化。 |
晚期EPCs增强新生血管生成，原因在其高增殖潜能，能提供足量的内皮细胞。 |
内皮祖细胞的鉴定（双标记法）：
内皮祖细胞常用的鉴定方法有根据细胞表面表达的特异大分子（表面标志）和特有的功能。双荧光标记法就是最最常用的内皮祖细胞鉴定方法。主要利用两大特性：
1. 内皮祖细胞（EPCs），不论是早期EPCs还是晚期EPCs都能够吞噬DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）。因EPCs上含有特异性识别修饰LDL的“清道夫”受体（Scavenger receptors），吞噬DiI-Ac-LDL，导致大量带负电荷的脂质小滴进入，产生类似动脉粥样硬化斑块中发现的泡沫样细胞。而DiI保留在细胞膜上，使得细胞呈红色荧光。
2. 内皮祖细胞（EPCs），不论是早期EPCs还是晚期EPCs，能够结合凝集素（lectin）-Ulex Europaeus Agglutinin I（荆豆凝集素I），从而使细胞呈绿色。
当两种标记呈阳性的即可鉴定为正在分化的EPCs。
内皮祖细胞的鉴定（双标记法）方法和参考文献：
1. 双标记方法：为了鉴定EPCs，贴壁细胞先用2.4 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）孵育1h，用2%多聚甲醛固定，之后用10 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）孵育。荧光显微镜观察染色结果【图1 Human MNCs经定向培养后的EPCs鉴定】。
图1：荧光显微镜（40×物镜）双荧光标记细胞，结果显示A（左）为DiI-Ac-LDL阳性；A（中）为FITC-UEA-1阳性；A（右）为两种荧光结合，显示两种荧光染色重叠。
文献来源：Rehman J, et al. Peripheral Blood “Endothelial Progenitor Cells” Are Derived From Monocyte/Macrophages and Secrete Angiogenic Growth Factors. Circulation. 2003 Mar 4;107(8):1164-9.
2. 双标记方法：为了鉴定从5天G-CSF处理的大鼠外周血MNCs培养在纤连蛋白包被的培养小室玻片7
天。贴壁细胞用2.4 μl/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）120min，之后用2%多聚甲醛固定10min。用10 μg/ml FITC-UEA-1染色。
文献来源：Chen YH, et al. High Glucose Impairs Early and Late Endothelial Progenitor Cells by Modifying Nitric Oxide–Related but Not Oxidative Stress–Mediated Mechanisms. Diabetes. 2007 Jun;56(6):1559-68. Epub 2007 Mar 26.
3. 双标记方法：为了鉴定EPCs，贴壁细胞先用4 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）37°C孵育2h。PBS清洗细胞，然后用2%多聚甲醛固定10min。为了验证其与内皮细胞特异性凝集素的结合性，细胞经EDTA消化后，用50 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）4°C孵育1h。FACS分析检测效果。
文献来源：Eggermann J, et al.Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood. Cardiovasc Res. 2003 May 1;58(2):478-86.
4. 双标记方法：为了鉴定鸡EPCs，贴壁细胞先用12 μg/ml DiI-Ac-LDL（货号：MP6013-500UG）37°C孵育4h。PBS清洗细胞，细胞清洗（5min/次，3次），然后用2%多聚甲醛固定10min。之后用10 μg/ml FITC-UEA-1（货号：MP6308-500UG）室温孵育1h。共聚焦显微镜观察染色效果。
图2：荧光显微镜（40×物镜）双荧光标记观察鸡EPCs对探针的吸附能力，结果显示A：相差；B：DiI-Ac-LDL阳性（红色）；C：FITC-UEA-1阳性（绿色）；D：DiI-Ac-LDL阳性+ FITC-UEA-1阳性（双阳性，黄色荧光）；E：合并图片；
文献来源：Chunyu Bai, et al. Characterization of vascular endothelial progenitor cells from chicken bone marrow. BMC Vet Res. 2012; 8: 54.
▶ 产品订购：更大包装或产品技术问题，请来电/在线咨询，电话：021-54736159 。网站：www.maokangbio.com。
|
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
|
MP6013-500UG |
红色荧光乙酰低密度脂蛋白 |
500μg |
2480 |
2-3天 |
|
MP6308-500UG |
FITC-UEA-I (FITC labeled Ulex Europaeus Agglutinin I) FITC标记荆豆凝集素 |
500μg |
1280 |
现货 |
|
MP6309-100UG |
Rhodamine-UEA-I罗丹明标记荆豆凝集素I |
100ug | 590 |
现货
|
|
MP6014-500UG |
Human DiO-Ac-LDL绿色荧光标记人源乙酰化低密度脂蛋白 |
500ug | 2880 |
2-3天
|
【好消息】：针对FITC-UEA-I，现特惠提供100ug（100ul）小包装，货号：MP6308-100UG，特价：560元。按照1:100（IF/ICC）的稀释比例，每张片需100ul染色工作液的条件来孵育，此规格可染100张片。
同时提供原装进口的双染色产品，订购信息如下：
|
品牌 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
价格（元） |
货期 |
|
Thermo（Molecular Probe） |
L3484 |
Human DiI-Ac-LDL |
200 µL |
8310 |
2-3周 |
|
Sigma |
L9006-1MG |
FITC-UEA-I（FITC-UEA-1） |
1mg |
2106 |
2周 |
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】
上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科学和生物技术领域研究的试剂、仪器和实验室消耗品与实验服务工作，主要从事细胞生物学、植物学、分子生物学、免疫学、生物化学、蛋白组学。生物制药与诊断试剂研发生产等领域。 本公司秉承“以人为本，以诚为信、合同守信”的经营理念。坚持"品质保障"的原则为广大客户提供优质产品。
