Puromycin Dihydrochloride 嘌呤霉素盐酸盐

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Puromycin 嘌呤霉素；G418 Sulfate G418硫酸盐；Geneticin遗传霉素；Puromycin resistance gene (Pac)；Blasticidin S 杀稻瘟菌素（灭瘟散）；Zeocin博莱霉素；CAS：58-58-2

产品信息

产品描述

嘌呤霉素（Puromycin），来源于白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）代谢产物的一种氨基糖苷类抗生素，

有效抑制革兰氏阳性菌生长，对抗酸杆菌的抑制活性相对较弱，但对革兰氏阴性菌的抑制活性更弱。还能抑制原生生物、藻类、哺乳动物和昆虫细胞的生长，一般2天内能杀死99%的细胞。作用机制在于：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的结构类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸肽链中，导致肽链合成的永久终止，进而阻止蛋白质合成。嘌呤霉素还具有抗肿瘤活性。作为蛋白合成抑制剂，用来研究细胞分化中控制基因顺序表达和协同表达的转录调控机制。

对嘌呤霉素的抗性来自嘌呤霉素产生菌内发现的pac基因，其表达产物嘌呤霉素N-乙酰转移酶（puromycin N-acetyl-transferase）可通过乙酰化嘌呤霉素使其失活。这一特性使得嘌呤霉素常用来筛选和维持培养携带pac基因的哺乳动物细胞株，特别是慢病毒感染的细胞株。现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。某些情况下，也能用来筛选携带pac基因的大肠杆菌菌株。嘌呤霉素在CRISPR/Cas9基因编辑系统中也发挥重要作用。

本品为嘌呤霉素的二盐酸盐形式，CAS NO：58-58-2，粉末形式，可溶于水配制成50mg/ml储存液，0.22µm滤膜过滤除菌后，-20℃冻存。真核细胞常用的筛选浓度为1-10µg/ml。

产品特性

1）   化学名：3'-[α-Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]-3'-deoxy-N,N-dimethyladenosine dihydrochloride

2）   同义名：Stylomycin hydrochloride; CL 13900 dihydrochloride; P638 dihydrochloride; CL16536; NSC 3055;

3）   CAS NO：58-58-2

4）   分子式：C22H29N7O5·2HCl

5）   分子量：544.43 g/mol

6）   外观：白色至灰白色粉末

7）   纯度：＞98% (HPLC)

8）   熔点：175-177 °C

9）   溶解性：溶于水（50mg/ml），乙醇（~1mg/ml），DMSO（~10mg/ml），PBS，pH 7.2（~10mg/ml）

10）化学结构： 

保存与运输方法

保存：-20℃干燥保存，4年有效。

运输：冰袋运输。

使用方法

1、  储存液制备

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的储存液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，按照单次用量分装，于-20℃冻存，避免反复冻融。也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

2、  建议工作浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株，使用浓度为100-125μg/ml。

【注意】：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身状态影响。

3、杀灭曲线的建立

嘌呤霉素合适的筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、代谢情况，以及细胞所处周期等因素有关。为了筛选到稳定表达的细胞株，确定杀死未转染或感染细胞所需的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），筛选到适合自身实验体系的最优筛选浓度。

1）   于24孔板加入500 μl/孔制备好的细胞悬液，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。理想情况开始抗生素筛选时，细胞达到较高的密度（~60-80%），常用的细胞密度如下：

贴壁细胞：0.8 - 3.0 x 105cells/ml

悬浮细胞：2.5 - 5.0 x 105cells/ml

2）   准备筛选培养基：含梯度浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（比如，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，这11个筛选浓度，每个浓度2个复孔）；

3）   将孵育过夜的细胞清洗后，更换新鲜制备的梯度筛选培养基；之后置于37℃，5%CO2培养箱内孵育；

4）   根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

5）   每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非感染细胞的抗生素最低浓度，也就是将用到的最优筛选浓度。

【注意】：如果发现细胞开始变圆但没有从平板表面脱落可能是以下情况，

a）变圆但是未脱落是细胞开始死亡的一个信号，这些需要更长的筛选时间；

b）若在建议浓度1-10μg/ml范围内还不能完全处死细胞，此时需要检测药物是否有效，避免药物的反复冻融（<5）。

注意事项

1）   嘌呤霉素为有毒化合物，操作时需注意防护，切勿与身体或皮肤直接接触。

2）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

常用筛选抗生素及其使用浓度

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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文献引用：

1）Li, X., Tang, M., Zhu, Q. et al. The exosomal integrin α5β1/AEP complex derived from epithelial ovarian cancer cells promotes peritoneal metastasis through regulating mesothelial cell proliferation and migration. Cell Oncol. (2020).

SKOV3 cells were transfected with a luciferase reporter vector containing a puromycin resistance gene (SKOV3-luc) and grown in complete medium supplemented with3 μg/ml puromycin (Shanghai MaoKang Biotechnology, MS0011-25MG).The cells were maintained in culture for no more than 10 passages and they were authenticated using short tandem repeat (STR) analysis every six months.

2）Zhou J et al. Exosomes Released from Tumor-Associated Macrophages Transfer miRNAs That Induce a Treg/Th17 Cell Imbalance in Epithelial Ovarian Cancer. Cancer Immunol Res December 1 2018 (6) (12) 1578-1592; DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-17-0479

The original cell culture medium was then removed, and the lentivirus was added to the cells and incubated overnight. After 24 hours of infection, the culture medium containing the lentivirus was removed and replaced with fresh culture medium. After 72 hours, the transfected cells were grown in complete high-glucose DMEM with puromycin (3 μg/mL; Shanghai MaoKang Biotechnology, MS0011-25MG) for purity screening.

3）Chen X et al. Exosomes derived from hypoxic epithelial ovarian cancer cells deliver microRNAs to macrophages and elicit a tumor-promoted phenotype. Cancer Lett. 2018 Oct 28;435:80-91. doi: 10.1016/j.canlet.2018.08.001. Epub 2018 Aug 8.

The SKOV3 cell line was transfected into a luciferase reporter along with puromycin resistance gene (SKOV3-Luc-pur), which was grown in RPMI-1640 with 10% FBS, Gibco, 1% antibiotics (Gibco), and 3 μg/ml puromycin (Shanghai MaoKang Biotechnology, MS0011-25 MG) for purity screening.