GT115 Electrocompetent Cell

大肠杆菌电转感受态细胞

产品标签：

GT115电击感受态细胞；TOP10；DH5α Electrocompetent Cell；DH10B；XL1-Blue；1mm电转杯（电击杯）；Biorad 1652083；

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菌株描述

GT115菌株是一款特别开发用于含R6Kγ复制原点和携带发夹结构等二级结构的质粒DNA进行克隆和扩增的大肠杆菌菌株。GT115含pir基因，可以编码利用R6Kγ为复制子的载体所必需的π蛋白。发夹结构在大肠杆菌内是很不稳定的，因为菌体内存在的SbcCD蛋白复合体会识别并切除发夹结构。通过基因突变删除大肠杆菌内的sbcC和sbcD基因，能显著改善含发夹结构质粒重组克隆的稳定性和拷贝数。rpsL(StrA)基因赋予菌株链霉素抗性。

GT115菌株基因型： F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrA) endA1 ∆dcm uidA(∆MluI)::pir-116 ∆sbcC-sbcD 

产品描述

我司（懋康生物）提供的GT115电转感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒（AmpR）检测转化效率>1×1010 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞最好保存在-80℃以下，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3） 加入DNA的体积不应大于感受态体积的1/10。DNA不纯或存在盐、乙醇、蛋白及缓冲液等污染时，会导致转化效率急剧下降。

4） 为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5） 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

6） 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

7） 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

8） 对于连接产物转化：最好在转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液重悬产物，保证DNA浓度不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

9） 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头（普通200μl枪头应剪去枪头尖0.6cm）。避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。

2) 取-80℃保存的感受态细胞插入冰中5min，待其完全融化。

3) 往50μl感受态细胞悬液中加入目的DNA（质粒或连接产物），用手拨打管底使其混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

【注意】：要测定转化效率，请使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或50℃重组体系不用纯化，可直接与GT115电转感受态细胞混合后进行电击转化，需控制DNA浓度≤100ng/μl，体积≤5μl/50μl感受态细胞。

【注意】：对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系需用膜纯化或乙醇沉淀纯化DNA，之后加入ddH2O重悬，然后与电击感受态细胞混合进行电击转化。

4) 用枪（注意所用的枪头用剪刀剪掉0.5cm尖头）轻轻吹打混匀感受态细胞-DNA之后快速转移到电击杯中，避免产生气泡，轻轻晃动使液面保持水平，盖上杯盖，插入冰中。

5) 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐参数来操作），将电击杯从冰内取出，用吸水纸擦干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后取出电击杯放室温。打开杯盖，15s内加入900μl无抗生素的无菌S.O.C.培养基（已提前预热到37℃，每管感受态准备10ml S.O.C.培养基），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管，向离心管内补加预热的S.O.C.培养基定容至10ml。于37℃，225rpm振荡复苏培养1h。

【注意】：S.O.C.培养基配方: 2% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20mM glucose。S.O.C.培养基营养丰富，主要用于大肠杆菌感受态细胞转化的复苏步骤，能最大化感受态细胞的转化效率。

6) 5,000rpm离心1min，重悬后取100~200μl加到含相应抗生素的S.O.C.平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径150mm培养皿2~5个），用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养13~17h。 

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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