Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells

细胞线粒体分离试剂盒

产品信息

产品描述

细胞线粒体分离试剂盒（Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells）是一款快速便捷的分离培养细胞内线粒体的试剂盒。本试剂盒在分离线粒体的同时，还能获得不含线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素c等线粒体蛋白向胞浆的释放。经本试剂盒获得的大部分线粒体都含有完整的内膜和外膜，且维持线粒体生理功能，因此，分离所得的线粒体可用于线粒体膜电位等生理功能相关研究。另外，分离得到的线粒体也可被线粒体裂解液或其它适当裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。

产品组分

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年稳定。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）   进行实验之前务必阅读试剂盒操作流程，根据最终实验目的选择试剂盒内所要用到的试剂。

2）   若不是用于制备线粒体蛋白样品，不必往线粒体裂解液和清洗液中加PMSF。

3）   分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷，全部操作时间尽量控制在1h之内。

4）   通常，在分离线粒体时前后两次离心速度选取1000g和15,000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可以采用2000g和6000g。

5）   细胞计数（如台盼蓝染色）对于不同实验不必全部使用，实验条件成熟后可不用。

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

自备材料

1）（可选）胰酶-EDTA细胞消化液

2）（可选）台盼蓝染色液

3）（可选）BCA蛋白定量检测试剂盒

4）PBS

5）低速离心机

6）匀浆器

使用方法

1.      试剂准备：从冰箱取出所需试剂置于室温融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果实验目的是为了制备线粒体蛋白样品，需在线粒体裂解缓冲液和清洗液内添加PMSF (100×)，使其终浓度为PMSF (1×)。PMSF一定要在试剂加入到样品前1-2min内加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2.      收集细胞：

2.1 对于贴壁细胞：用预冷的PBS清洗细胞1次，胰酶消化，100-200g 4℃离心5-10min收集细胞。

2.2 对于悬浮细胞：直接离心收集细胞。

3.      清洗：用预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，如有必要，取少量细胞用于计数。剩余细胞600g 4℃离心5min沉淀细胞，弃上清。【注意】：单个样品细胞量≥106个，一般控制在2-5×107个。

4.      裂解：往沉淀内加入1-2ml预冷的线粒体裂解液重悬细胞，冰内孵育10-15min，可用相差显微镜检测细胞膨胀程度。

5.      匀浆：把细胞悬液转移到Dounce匀浆器中，匀浆10-20次。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。【注意】：通常，可以在匀浆10次后取约2μl细胞匀浆，加入30-50μl台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性（蓝色）细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50%，增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50%时即可停止匀浆进入下一步。请勿过度匀浆，过度匀浆会导致线粒体的机械损伤。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。

6.       取匀浆液，立即加入等量清洗液，轻轻颠倒混匀数次。

7.       4℃ 1300g离心5min以去除细胞核、未破碎细胞和大的膜碎片。

8.       上清液转移至一干净离心管，4℃ 1000g离心5min，重复2次。

9.       上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000-15000g离心15min，重复1次。

10.    弃上清，沉淀即为线粒体。需注意，如果希望获得去除线粒体后的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，且在收集上清的过程中不要触及沉淀，随后把收集的上清4℃ 12000g 离心10min，此时即得到去除线粒体的细胞浆蛋白。

11.    保存：弃上清，用适当的缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能分析，线粒体沉淀需重悬于线粒体保存液中；如果用于细胞浆蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于蛋白保存液（1×），即按照：细胞浆蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于双向电泳，应使用其它适宜的保存液。

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